任蓉蓉，陈红全

1.浙江医院 医学检验科，浙江 杭州 310013；2.浙江大学医学院附属邵逸夫医院 检验科，浙江 杭州 310016

CRISPR/Cas9系统是强大的基因编辑工具，近几年得到广泛的应用[1-4]。近期，研究者将APOBECs（members of the apolipoprotein B mRNA-editing enzyme,catalytic polypeptide-like）蛋白和CRISPR系统紧密的联系在了一起[5-7]。我们的前期研究发现应用Cas9-D10A/sgRNA进行基因编辑时，APOBEC-3B蛋白能够引入非目的突变[5]，因此有必要优化Cas9-D10A/sgRNA系统的保真性。应用Cas9-D10A/sgRNA进行基因编辑时，D10A能够切割双链DNA的单链后形成切口样结构，从而暴露出DNA单链，而APOBECs蛋白具有胞苷脱氨酶活性，能够攻击单链DNA的胞嘧啶脱氨使其变为尿嘧啶，使单链DNA发生碱基突变。本研究根据上述现象提出以下理论设想：对Cas9-D10A/sgRNA系统设计csgRNA（chaperone sgRNA），使D10A进行基因编辑时产生的DNA单链结构能够与csgRNA形成碱基互补配对，从而形成双链样结构，降低APOBECs的攻击，以减少APOBECs对Cas9-D10A进行的基因操作形成的单链DNA引入突变，从而降低突变率。

1 材料和方法

1.1 质粒构建与引物设计 Cas9（pST1374-N-NLSFlag-linker-Cas9）、D10A（pST1374-N-NLS-flaglinker-D10A）、H840A（pST1374-N-NLS-flag-linker-H840A）和dCas9（pST1374-N-NLS-flag-linker-dead Cas9）等表达载体由上海科技大学黄行许教授馈赠，sgRNA表达载体由pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro（Addgene 51133）构建完成；sgRNA4和FANCF打靶位点的sgRNAs序列和其各自的上下游PCR引物序列见表1。

表1 sgRNAs序列和引物序列

1.2 细胞培养和转染 293FT、293FT-A3B和293FTA3Bm细胞系由上海科技大学陈佳教授馈赠，所有细胞均在DMEM（10566，美国Gibco公司）+10% FBS（16000-044，美国Gibco公司）、37 ℃条件下培养；细胞以2×105/孔，接种于12 孔细胞培养板，8 h后用LipofectamineTM2000（美国Thermo Fisher Scientific 公司）转染，转染试剂包括125 μL Opti-MEM+2 μg Cas9表达载体+1 μg sgRNA表达载体+3 μL Lipofectamine，24 h后加终质量浓度为 1 μg/mL的嘌呤霉素（ant-pr-1，美国InvivoGen公司）药筛，48 h后用酚氯仿法抽提基因组DNA。

1.3 T7EN1酶切实验 首先用PCR方法扩增sgRNA打靶位点上下游DNA序列，PCR反应程序如下：94 ℃，5 min；（98 ℃，10 s，72～62 ℃，每循环降低1 ℃，15 s；72 ℃，30 s）10个循环，（98 ℃，10 s；……