苏 鹏，黄洋铭，兰天鑫，卢小芳，林春建，蓝贤勇，张清峰,3,4*(1. 西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2. 天津奥群羊业研究院有限公司，天津 301607； 3. 天津奥群牧业有限公司，天津 301607；4. 天津市肉羊遗传育种企业重点实验室，天津 301607)

我国不仅拥有悠久的绵羊驯化与饲养历史，还有丰富的品种资源，现有绵羊品种71个正式列入《中国羊品种志》[1]。目前，我国绵羊存栏量和年出栏数均位居世界第一，是名副其实的羊肉生产大国。但是，我国绵羊的生产水平仍未达到世界先进水平，绵羊生长所存在的问题主要表现为生长慢、平均胴体重低等方面。为此，开展品种选育、新品种(品系)培育、杂交改良和分子育种有一定的必要性，而品种改良或新品种(或品系)培育最有效的策略就是分子标记辅助育种(MAS)，在这一过程中寻找和确定生长性状关键基因是“卡脖子”的环节。本文综述了绵羊正向调控和负向调控基因的研究进展，及其对生长性状的遗传效应，旨在阐明不同候选基因对绵羊生长性状的影响，为绵羊生长相关性状的分子育种提供科学资料。

1 生长性状关键基因挖掘策略

1.1 候选基因策略

根据生物功能或图谱定位把假定影响某个性状的基因称为候选基因，该候选基因的DNA多态性可能与表型性状相关，或与研究的性状位点存在遗传连锁[2]。Ahbara等[3]揭示了关于埃塞俄比亚本土绵羊的骨骼结构和形态以及脂肪沉积的相关候选基因，有助于进一步了解绵羊体内脂肪代谢的遗传机制。刘家鑫等[4]利用长纯合片段信息评估不同绵羊群体的近交情况，并鉴定与绵羊经济性状相关的候选基因，可为绵羊种群育种和保种提供参考依据。Gebreselassie等[5]综述了影响绵羊生长发育与繁殖相关的候选基因和基因组区域，对未来的遗传改良计划具有一定的意义。张壮彪[6]基于TMT的下丘脑蛋白质组学分析，筛选出多个影响绵羊经济性状的候选基因。正因为候选基因法具有多态位点选择简单、统计检验效率高、总花费少、便于操作、试验结果易于应用等优点[7]。该方法已成为基因组分析的首选。

1.2 全基因组关联分析法(GWAS)

全基因组关联分析 (Genome-wide association study, GWAS) 是鉴定某一群体内目标性状与遗传标记或候选基因关系的分析方法，通常也被称为关联作图或者连锁不平衡分析，其遗传基础是连锁不平衡[8]。2005年，Klein等[9]发表了第一篇关于视网膜黄斑病的GWAS研究，开启GWAS研究的新时代。近年来，伴随着相关学科的不断发展，与之相关的测序技术也在不断完善，多种动物的全基因组测序和组装工作相继完成。与此同时，生物信息学及分子标记技术的发展与更新，使更多专家和学者开始在绵羊的经济性状、遗传疾病以及品种特征等方面开展GWAS研究，并更好的应用于绵羊的遗传育种。通过对绵羊基因组进行GWAS分析研究，最终找到了重要的SNPs与经济性状显著相关，从而更好的揭示了遗传机理。随着芯片技术的不断发展，Kijas等[10]在2009年推出了绵羊的Ovine SNP50 BeadChip，可利用该技术更加深入的研究绵羊重要的经济性状。Becker等[11]在2010年首次发表与绵羊相关的GWAS论文，自此之后与绵羊相关的GWAS文章相继发表。且新一代测序(next-generation sequence, NGS)技术的飞速发展，研究人员开始对绵羊进行denovo测序，并于2014年完成，这进一步促进了绵羊GWAS研究。Greyvenstein等[12]对Damara绵羊的606006个SNPs标记信息进行基因型分析，发现HOXD基因与绵羊的多角性状相关。同年，Ren等[13]基于单倍型关联分析对羊多角性状进行QTL定位发现4个显著性的SNPs，均位于2号染色体132.0-133.1Mb的基因组区域，该区域与HOXD、EVX2和KI-AA1715基因相邻。2018年，Rovadoscki等[14]对绵羊脂肪酸沉积进行全基因组关联分析，最终确定了23个候选基因与绵羊的脂肪酸沉积相关。此外，Ghasemi等[15]对132只绵羊的41323个SNPs位点与羔羊初生重进行全基因组关联分析，发现RAB6B和GIGYF2两个基因与绵羊的初生重显著相关。Cao等[16]在2020年利用GWAS，在湖羊核心种群中发现了CAPN6基因的2个SNP与体重相关性状有关。目前利用GWAS方法筛选获得的这些候选基因，有望为培育优良品种提供良好的基因靶标。

1.3 SNP芯片与基因芯片技术

SNP芯片是一种可以自动检测SNP并具有并行性的技术。芯片上含有大量的DNA或探针，待测样本的靶序列会与探针结合反应，通过荧光和化学发光标记来读取每个位点的信息[17]。李铁锋等[18]通过对布氏杆菌特定菌株的抗原构建了适用于布氏杆菌的膜基因芯片技术，其特异性较强，便于在小型养殖场使用。Brito等[19]在14 845只绵羊中，使用HD SNP芯片技术通过基因组选择以提高其生长性状，在较早的生长阶段就可以推算出相对准确的育种值，从而节省时间成本并缩短了世代间隔。Signer等[20]利用SNP芯片技术，在瑞士本土的939只绵羊中利用基因组区域的识别，揭示了地方绵羊品种在高山环境中的品种分化。其研究发现了几个与生长性状强相关的候选基因，以此更好的了解地方绵羊品种之间的基因组差异。马丽娜等[21]利用7组SNP位点，对三个不同场区的滩羊种公羊进行亲缘关系测定，发现这三个区域的种公羊之间有亲缘关系。目前，基因育种芯片的开发主要包括挖掘遗传性状的高密度芯片和用于后期商品化的低密度芯片。如果合理的运用这些SNP育种芯片，这将不断推动群体遗传结构分析以及品种培育的进程，并完善了中国羊业的育种工作。由此可见，基因芯片技术在绵羊遗传育种中做出了巨大贡献。

1.4 全基因组重测序技术

随着现代生物技术的不断发展与进步，2003年人类基因组计划的测序工作完成。之后，世界各国又将关注点转移到了动物身上。到目前为止，已经完成了数百种动植物的参考基因组序列的测定。完成绵羊品种的全基因组测序，对绵羊育种技术的科学研究及将来在生产实践的应用意义重大。2013年，Dong[22]报道了一只母羊的基因组序列，并发现51个基因在初级毛囊和次级毛囊之间存在差异表达。该结果将促进羊类基因组学的研究发展。Li等[23]通过对16只野羊(亚洲摩弗伦)和来自世界各地的232只家羊个体进行高度全基因组测序，进行平均深度为25.7×的高深度重测序，基因组平均覆盖率达到98.27%，共获得20.55Tb的数据。通过对绵羊全基因的遗传多样性、全基因组关联等分析，全面地揭示绵羊在驯化、培育改良以及表型性状上的遗传机制。Pasandideh等[24]运用全基因组测序技术发现了Baluchi绵羊存在5个SNP位点和4个与八月龄体重显著相关的候选基因(MTPN、HYDIN、LRGUK和ZFP90，其中MTPN参与了骨骼肌生长的调节)。Chantepie等[25]发现,BMP15基因上游的一个新的SNP,这一变异可能会影响BMP15在卵母细胞中的表达，以此来影响绵羊的排卵率和繁殖力。2021年，Yao等[26]通过全基因组测序，筛选到三个JUN、ITPR3和PLCB2基因在促性腺激素释放激素、催乳素和雌激素信号通路中起重要的调节作用。这些结果，为培育高产优质的绵羊品种提供了新的思路。绵羊全基因组的研究可以更完整地帮助分子标记辅助选择技术以及基因编辑技术的应用。

2 生长性状相关功能基因研究进展

2.1 正向调控基因

下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴是哺乳动物的一个至关重要的生物调节轴，也对绵羊的生长发育起着关键的调控作用。GH(Growth hormone,GH)、GHR(Growth hormone receptor,GHR)、PRL(prolactin,PRL)、POU1F1(POU domain, class 1, transcription factor 1,POU1F1)、PROP1(PROP paired-like homeobox 1,PROP1)都是HPA轴的关键基因(表1)。脑垂体前叶腺体是HPA轴重要的组成部分，同时也是哺乳动物生长发育的控制中心[27]。GH、GHR、PRL、POU1F1、PROP1关键基因遗传信息的改变，将直接或间接影响绵羊生长发育情况。因此，HPA轴关键基因是调控绵羊生长发育的重要候选基因群。

表1 正向调控基因Table 1 Positive regulatory genes

2.1.1 生长激素相关基因 近些年，关于GH、GHR等生长激素相关基因影响动物产奶产肉量的报道显著增加，对于该基因的研究也不断深入。生长激素可与下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA轴)的其他激素共同加速新陈代谢并直接调节机体蛋白质和肌肉的增加以及脂肪分解代谢[28]。此外，GH基因在动物生长发育过程中是一种重要的功能基因，它直接影响生长激素的合成与分泌。Sugita等[30]在牛GH基因启动子区域中鉴定出SNPs(C253T和C303T)影响日本黑牛的胴体性状。Jia等[31]发现藏绵羊GH基因5'UTR和3'UTR区3个新SNPs显著影响绵羊的生长性状(体重，体长，体高和心脏周长)。此外，Han等[32]利用DNA测序技术对632只中国藏羊的GH基因多态性进行了研究，发现第2外显子中同义突变位点(g.498 G>C)和内含子(g.616 G>A)突变位点与相关生长性状极显著或显著相关。闫云峰等[33]的研究发现，GH基因对萨福克羊的生长发育及肉质性状的改善有显著影响，并且GH基因具有一因多效的作用。白俊艳等[34]发现GH基因第2内含子的5 个Indel位点与绵羊的多个生长性状显著相关。已有众多研究表明GH基因可以作为改良家畜生长性状的候选基因。

GHR基因编码的蛋白能够与GH结合，由GHR介导将信号传入细胞内，从而调节生物发育的一系列过程。Yang等[35]在山羊GHR基因第1内含子检测到新的14 bp indel位点，其中野生型(II)个体具有更优秀的生长性状，如体高、体长、胸宽、胸深等，而且 II型个体(n=708)表现出比突变型(ID)个体明显更好的第一胎产羔数。Wu等[36]发现GHR的3个indel位点与湖羊、同羊、兰州大尾羊和小尾寒羊的生长性状密切相关，可以调控4个绵羊品种的重要生长指标，优势基因型的选择可作为提高4个绵羊品种生产性状和肉品产量的分子育种的理论依据。Akhatayeva等[37]对922只澳白母羊进行研究发现，GHR基因indel多态性对澳白母羊的第一胎的产仔数显著相关。

2.1.2 催乳素(PRL)基因 催乳素 (prolactin,PRL) 是动物生长发育重要的生长因子。催乳素对妊娠期的乳腺上皮细胞的增殖及分化等功能有着重要的作用[38]。乳腺的发育和乳汁的生成都是依靠催乳素来促进乳腺小液泡的生成和功能的分化[39]，并直接影响乳腺乳蛋白的合成。绵羊催乳素蛋白由 228 个氨基酸组成，与牛、山羊氨基酸序列同源性达 90%以上，其蛋白结构与GH基因相似，均是由4个α螺旋组成。PRL基因被视为与绵羊生长性状相关的重要候选基因。李晓林[40]采取全基因测序的方法，找到PRL基因的5个SNP位点与湖羊的4项生长性状显著相关。PRL基因indel多态性对澳白母羊的第一胎的产仔数显著相关[37]。PRL基因的“I”等位基因可以被认为是揭示具有优良产仔数个体的分子标记。Mao等[41]发现在鲁西黑头绵羊中PRL基因中23 bp的插入突变与体重和身高等多项体尺指标显著相关。

2.1.3 垂体转录因子(POU1F1)基因 垂体转录因子(POU domain, class 1, transcription factor 1,POU1F1)，是POU家族的成员之一，它在动物的垂体前叶中可以激活GH、PRL和TSHβ基因的表达，可有效调节哺乳动物的激素表达与垂体发育。根据其在垂体发育和激素表达中的重要作用，理论上认为该基因是影响生长发育等生长性状的重要候选基因。研究表明，垂体发育的不健全，可能是受到了POU1F1基因突变的影响，使GH、PRL、TSHβ基因不能正常表达，从而使个体因多种垂体激素的缺乏而导致矮小现象的出现[42]。此外，Jalil-Sarghale等[43]发现POU1F1基因第3外显子的SNPs也与两个伊朗绵羊品种Zel和Lori-Bakhtiari的生长性状相关。赵宪林等[44]发现在477头藏羊POU1F1基因上的突变位点g.14205G>A、g.15223G>A和g.15286A>G均能够显著影响其生长发育，优势基因型分别为AA、GG和AA。其个体的体重、体高和体长大于其他双倍型。

2.1.4 垂体特异性转录因子祖先蛋白(PROP paired-like homeobox 1，PROP1) 垂体特异性转录因子祖先蛋白(PROP paired-like homeobox 1，PROP1)是一种垂体的特异性转录因子，并且只在哺乳动物的垂体中表达。PROP1基因结构较为保守，主要包括三个功能区域：氨基端区、羧基端区和蛋白区，其中蛋白区是识别和结合特异性DNA序列的区域[45]。作为下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴(HPA轴)的参与基因之一，该基因编码一种调节哺乳动物生长和发育的蛋白质，具有DNA结合和转录激活能力，能够控制重要的垂体前叶激素的表达，包括GH和PRL等。该基因的相关突变会导致其TSH、PRL、GH表达的降低，还会引起促卵泡激素或促黄体激素分泌的减少，导致小鼠的生长发育减缓，繁殖性能降低[47]。Zeng等[48]研究发现在345只中国美利奴绵羊中PROP1基因的外显子1～3中有10个新的SNPs，其中P4各基因型与羊毛纤维直径有显著影响。Ekegbu等[49]在670只新西兰罗姆尼绵羊中检测到3个SNP位点，其中两个位于内含子1中，一个位于外显子1。单倍型与较高的羔羊尾重和断奶重显著相关。这表明PROP1基因的变异可用于标记辅助选择中用来培育优良新品种。Mao等[41]也同样证明了PROP1基因的相关突变与鲁西黑头绵羊的产羔显著相关。

2.2 负向调控基因

生长相关基因有些会促进绵羊的生长发育、脂肪沉积等，有些也会抑制相关性状的表达。其中，MSTN、SIRT、IGF2BP1、PRNP、PDGFD等基因的表达都会抑制绵羊的生长(表2)，为此，正确发现并识别相关抑制生长的基因，利用分子标记辅助育种等技术手段敲除或降低相关基因的表达，以此为培育高产优质的绵羊新品种提供了更多样的选择。

表2 负向调控基因Table 2 Negative regulatory genes

2.2.1 肌肉生长抑制素(MSTN)基因 肌肉生长抑制素(Myostatin，MSTN)又称生长分化因子8，是骨骼肌发育的重要调节因子之一。MSTN基因在家畜出生前后都有着十分重要的作用，它决定家畜整体肌肉含量[50]。Li等[51]发现MSTN突变的小尾寒羊可以正常的生长发育，而且体重和肌肉的生长与突变显著相关。姚力丹等[52]研究发现阿勒泰羊、吐鲁番黑羊、也木勒白羊、哈萨克羊、巴什拜羊MSTN基因表达水平与生长性状多呈强、中负相关，这表明MSTN基因mRNA表达水平可能与骨骼的生长有直接关系。Zhang等[53]研究证实miR-27b可以通过靶向MSTN并抑制其表达来促进绵羊骨骼肌卫星细胞的增殖。Zhang等[54]运用CRISPR/Cas9技术敲除绵羊的MSTN基因，通过MSTN基因的敲除提高绵羊肌肉品质和经济效益。Grochowska等[55]鉴定了MSTN基因的第一个内含子和C.*1232G>A位置的多态性，并对其基因型与美利奴绵羊的胴体、肉质和生物特征之间进行了关联分析，发现MSTN基因多态性可被认为是绵羊胴体品质，肉质和生物特征的遗传标记。

2.2.2 沉默信号调节因子(SIRT)基因家族 沉默信号调节因子(silent information regulator)即Sirtuin(SIRT)在哺乳动物中，Sirtuin蛋白家族有7个成员：SIRT1-SIRT7。研究表明,SIRT4基因和SIRT7基因的单核苷酸多态性与秦川牛等品种体尺性状(如体长、胸围等)和肉质性状(如背膘厚、眼肌面积等)显著相关[56]。SIRT基因的突变也表明能影响家畜的生产发育。目前，SIRT相关基因多态性的研究主要集中在牛的SNP或单倍型突变上，而对绵羊SIRT基因多态性的研究并不多。2019年，徐红伟[57]研究表明，SIRT7分别在5'UTR-insertion-7bp和3'UTR-insertion-17bp的indel多态性与绵羊的生长发育显著相关。Gui等[58]使用实时定量聚合酶链反应，分析确定了SIRT1和SIRT2在藏羊体内的表达模式。并发现其中的两个SNP(g.3148C>T和g.8074T>A)位点分别和胸围和体重显著相关。

2.2.3 胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1基因(IGF2BP1) 作为生长基因IGF2的mRNA结合蛋白，胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白1(IGF2BP1)，被报道具有促进细胞增殖、维持多种生长基因(如：CD44、MYC、CTNNB1、H19、KRAS)的mRNA稳定性等作用[59]。IGF2BP1基因，又称IMP1、ZBP1、CRDBP、VICKZ1和IGF2BP1，属于IGF2BP家族，IGF2BP家族是一种保守的RNA结合蛋白，会改变RNA的稳定性。IGF2BP1通过与IGF2基因mRNA的5'UTR结合并调节IGF2翻译而起作用。众所周知，IGF2是一种多功能细胞增殖调控因子，能显著促进细胞的增殖分化、胚胎的生长发育与肿瘤细胞的增殖[60]。故研究IGF2BP1与家畜生长发育是否相关具有重要意义。Wang等[61]在IGF2BP1基因中发现了5 bp和15 bp的新indel，并且在大样本中发现与山羊的生长性状显著相关。此外，对于5 bp和15 bp基因座，II-II和ID-II组合二倍体型对生长性状的影响最大，提示2个双倍型可能是羊类育种的重要遗传标记。Liu等[62]研究发现，在916只澳洲白绵羊IGF2BP1基因中的两个indel突变与产羔数显著相关。

2.2.4 朊蛋白相关基因 朊蛋白相关基因(主要包括PRNP、PRND和PRNT)除了调控“哺乳动物感染传染性海绵状脑病”外，这些基因的遗传变异也被报道与绵羊经济性状显著相关。绵羊朊蛋白基因(PRNP)的多个单核苷酸多态性(SNPs)，包括密码子136，154和171的突变，被证实能影响绵羊产奶性状和母羊机体储备的季节性动员[63-64]。Li等[65]发现在中国及蒙古国绵羊群体中，绵羊PRNP基因的4个indel多态性(内含子1-7 bp，内含子2-15 bp，内含子2-19 bp，3'UTR-7 bp)分别与13种不同的生长性状有显著相关性；绵羊叠朊蛋白基因(PRND)编码区上游20 bp indel位点的多态性与湖羊的管围指数和体躯指数存在显著相关[66]。Pereira等[67]的研究发现PRNT基因编码区的突变干扰了绵羊精子mRNA的转录水平和雄性的生殖能力，特别是胚胎的发育能力。Li等[68]在绵羊睾丸组织特异性表达的朊蛋白基因(PRNT)中，有6个SNPs位点(g.93G>A、g.162G>T和g.190A>G、g.17C>T、g.112G>C、g.129C>T、g.144A>G)的多态性被证实与绵羊体高、胸围、胸宽等10个不同生长性状之间存在显著相关性。

2.2.5 血小板源性生长因子D(PDGFD)基因 血小板源性生长因子D(platelet-derived growth factor D，PDGFD)基因是PDGF家族成员，该基因可能会影响血管生成、组织纤维化、肿瘤发生和脂肪代谢等，也会对绵羊尾部脂肪的沉积有着重要影响。Gladh等[69]发现PDGFD信号通过血小板衍生生长因子受体β传递，PDGFD基因敲除小鼠的血压略有升高。袁婷婷[70]的研究发现PDGFD基因的三个indel位点与同羊的尾长、体高、体长、胸深等生长性状显著相关。同时发现PDGFD基因表达的蛋白质通过形成二聚体来激活PDGFDβ通路，而该通路抑制了脂肪的扩增，这也验证了PDGFD基因负向调控绵羊尾部分脂肪的沉积。韩建刚[71]基于SNP芯片数据发现PDGFD基因与尾部脂肪沉积显著相关，并对PDGFD基因进行了功能验证，为脂尾选育提供了理论依据。Li等[23]发现,用全基因组选择分析，通过对长肥尾和短脂尾、肥臀和短瘦尾之间进行比较分析，其启动子区域的基因型分布，以及位于该基因的一个非同义突变位点的等位基因频率在肥尾和瘦尾羊中差异显著。同年，Dong等[72]在来自全世界各地的18个肥尾品种和14个瘦尾品种的968只绵羊中，统计检测了基因固定指数以及等位基因频率的差异，发现PDGFD基因在瘦尾羊和肥尾羊中表现出最高的遗传分化。

3 小结与展望

人们对影响绵羊生长性状的GH、PRL、POU1F1、PROP1、MSTN、SIRT、IGF2BP1、PRNP、PDGFD等正向、负向调控基因的研究，探究了其基因多态性与生长性状的关联性。利用筛选到的影响绵羊生长性状的重要候选基因，培育高产优质的绵羊新品种。但在筛选候选基因的研究中，存在一定的不足：(1)候选基因法检测有效信息相对较少、对未知基因无法检测。(2)全基因组关联分析主要依赖于统计数据的分析，会出现假阳性的结果，同时也无法识别复杂性状的所有遗传决定因素。(3)SNP芯片等测序技术成本高，不能建立有效参考群体。(4)相关研究仅仅停留在筛选与生长发育相关的候选基因的阶段，对于基因表达的验证以及与生长性状相关的遗传突变的作用机制研究较少。

随着生物信息学与多学科交叉，人们对绵羊的研究将更加深入、广泛。从过去低通量、耗时的限制性片段多态标记(RFLP)到如今高通量、高密度的单核苷酸多态性(SNP)标记，基因检测效率大幅提高。先进的基因组测序和基因分型技术促进了绵羊育种方法的革新。因此，将现代基因筛选技术与常规育种方法相结合，提高绵羊生长发育选择准确性，加速选择进程，促进产业发展。