王艳新 叶富跃 王 艳

胶质母细胞瘤（glioblastoma，GBM）是最常见和最具侵袭性的原发性恶性脑肿瘤[1]，即使采用手术联合术后放化疗，预后仍很差。因此，探讨其生物标志物对其临床诊治具有实际的临床意义。研究发现miR-126在多种肿瘤中表达失调[2]。本文探讨miR-126表达水平及基因启动子甲基化状态与GBM术后复发的关系。

1 资料与方法

1.1 标本来源 纳入标准：①符合原发性GBM（WHO分级Ⅳ级）诊断标准[3]；②临床资料完整；③手术前后影像学资料完整，术前没有接受放疗或化疗；④均接受显微手术，术后常规综合治疗。排除合并其他恶性肿瘤或自身免疫性疾病、心力衰竭、慢性阻塞性肺病、肝功能不全、肾衰竭。

收集2016 年8 月到2020 年12 月手术切除的石蜡包埋的GBM 组织标本86 例，其中男41 例，女45例；年龄25～83 岁，中位年龄51.0 岁；术前KPS 评分56～92 分，中位评分70.0 分。另选择颅脑损伤内减压术中切除非肿瘤脑组织30例，其中男15例，女15例；年龄23～85岁；中位年龄52.0岁。本研究经我院伦理委员会批准。

1.2 实时荧光定量PCR 法检测miR-126 水平 使用QIAamp DNA/RNA FFPE组织提取试剂盒（德国QIAGEN 公司）提取石蜡包埋组织基因组DNA/RNA[4]。将总RNA 样本依照RevertAid FirstStrand cDNA 合成试剂盒（美国Thermo Scientific 公司）和基因特异性环状引物进行逆转录反应，反应条件：将混合物在冰浴上孵育5 min，42 ℃60 min，70 ℃5 min。用ABI 7500 实时PCR 系统（美国Applied Biosystems 公司）进行PCR 扩增（扩增条件：94 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃60 s，40次循环，反应体积25 μl）。用2-ΔΔCt法以β-actin 为内参计算miR-126 mRNA 的相对表达量。数据用RNU6 标准化。miR-126 正向引物5'-TGCCTCGTACCGTGAGTAC-3'，反 向 引 物5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。

1.3 miR-126 甲基化状态检测[4]①取1 μg 组织总DNA，使用EZ DNA 甲基化试剂盒-Gold（北京中西远大科技有限公司）进行亚硫酸处理。用Wizard DNA 纯化树脂对修饰后的DNA 样本进行纯化。……