游思亮 王裔娜 田瑞平 王青

摘要：通过单因素试验，分析了均质压力、均质次数和菌液浓度3个因素对大肠杆菌蛋白破碎率的影响。然后利用响应面试验拟合出大肠杆菌蛋白破碎率的回归方程，优化了高压均质法破碎大肠杆菌的试验条件。结果表明，各因素对大肠杆菌蛋白破碎率影响顺序为均质次数（B）>均质压力（A）>菌液浓度（C）。在均质压力140 MPa、均质次数4次、菌液浓度60 g/L时，大肠杆菌蛋白破碎率达到最高，为13.98%。

关键词：响应面;高压均质;蛋白破碎率;大肠杆菌

中图分类号： S182  文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2021）17-0071-04

收稿日期：2021-01-10

基金项目：国家自然科学基金（编号：31801350）。

作者简介：游思亮（1984―），男，湖北武汉人，硕士，实验师，主要从事大型仪器设备管理和功能开发。E-mail：yousl@njau.edu.cn。

在生物学领域，经过改造过的细菌系统经常用来表达各种外源重组产物，如蛋白质、酶和抗体，大肠杆菌（Escherichia coli，简称E. coli）是其中最常见的寄主材料。这主要是由其特点决定的，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚、繁殖快、培养成本低、表达量高、表达产物容易纯化、稳定性好、抗污染能力强以及适用范围广等优势[1]。

但是重组蛋白通常在大肠杆菌细胞内部表达，不能被大肠杆菌分泌到细胞外部，要提取纯化蛋白还需要将大肠杆菌细胞破碎[2]。目前，用于提取大肠杆菌外源蛋白的常用细胞破碎方法主要有高压均质法、珠磨法、超声波破碎法、渗透压法、反复冻融法、酶解法和化学降解法[3-8]。高压均质法破碎细胞的原理是在高压条件下使溶液通过均质阀，溶液内细胞经过阀门的撞击力、通道内高速流体剪切力和瞬时压力差3个不同的作用力后被破碎，释放胞内物质达到细胞破碎的目的[9]。高压均质法作为一种物理破碎方式，具有破碎效率高[3-4]、无试剂消耗和污染[5]、可用于工业化生产等诸多优点[10]，正在被越来越多的研究者采用。

有学者利用高压均质法研究破碎大肠杆菌的试验条件[7]，但主要是探讨单个因素对破碎结果的影响，没有考虑到因素之间的交互作用，也没有探讨最优化的试验条件。本研究在单因素试验的基础上，利用响应面法探讨因素之间的交互作用以及最优化的试验条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：E. coli DH5α为南京农业大学小麦研究所保存，重组质粒pCold-10477为小麦研究所构建，按常规方法转化获得相应重组工程菌。

试剂：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、琼脂糖、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、卡那霉素、二硫苏糖醇（DTT），购自Sigma公司;Bradford蛋白质浓度检测试剂盒，购自上海碧云天生物公司;PBS缓冲液（pH值7.2），购自英潍捷基公司。

仪器：高压均质机（JN-Mini，广州聚能纳米公司）、酶标仪（Infinite200，TECAN）、离心机（CR21，Hitachi）、搖床（Ks4000，IKA）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌液的培养和收集 重组基因的E. coli DH5α工程菌采用两步法培养，取3 μL重组工程菌液接种到3 mL新鲜LB培养基（含50 μg/mL卡那霉素） 中，于37  ℃、220 r/min过夜培养15 h获得种子液。随后将种子也按照1%比例接种到新鲜LB培养基（含50 μg/mL卡那霉素）中，37 ℃、220 r/min 继续培养至D600 nm达到0.6左右，加诱导剂后继续16 ℃，150 r/min振荡培养15 h。每 100 mL 诱导后的菌液于10 000 r/min 离心5 min，收集菌体，加入预冷的PBS缓冲液（pH值7.2） 50 mL 洗涤1次，然后加入预冷的PBS缓冲液 15 mL，充分悬浮，悬浮液置于-4 ℃待用。

1.2.2 菌液浓度测定 当菌液在600 nm时的吸光度值D600 nm小于0.7时，D600 nm与菌液浓度呈线性关系[11]，可用来监测菌体生长情况，浓缩之后的菌液浓度用每升菌液中菌体湿质量（g/L）表示。

1.2.3 蛋白质浓度标准曲线的绘制 破碎之后上清液中可溶性蛋白的浓度用Bradford染色法测得[12]。将蛋白标准溶液分别稀释成1.500、1.000、0.750、0.500、0.250、0.125 mg/mL的浓度梯度，然后分别取5 μL不同浓度的蛋白标准溶液到96孔酶标板，每个孔各加250 μL的G250染色液，反应 5 min 后，用酶标仪测定595 nm处的吸光度，重复3次，得到标准曲线的方程为y=0.632 9x+0.532 5，相关系数r2=0.992 3，表明标准曲线相关性很好，可用于检测样品的蛋白质浓度。

1.2.4 蛋白破碎率的测定 用上清液中可溶性蛋白的浓度与菌体浓度的比值表示蛋白破碎率。

1.2.5 单因素试验设计 根据已有研究[7]，选取高压均质过程中关键影响因素均质压力、均质次数、菌液浓度，设计单因素试验，研究每个因素对破碎结果的影响，试验方案如下：（1）在菌液浓度为100 g/L，均质次数为3次时，分别用80、100、120、140、160 MPa均质压力破碎菌液，分析均质压力对大肠杆菌破碎结果的影响。（2）在均质压力为 120 MPa，菌液浓度为100 g/L时，分别均质1、2、3、4、5次，分析均质次数对大肠杆菌破碎结果的影响。（3）在均质压力为120 MPa，均质次数为3次时，分别用60、80、100、120、140 g/L浓度的菌液进行破碎，分析菌液浓度对大肠杆菌破碎结果的影响。

1.2.6 响应面试验设计 根据单因素试验结果，利用Design Expert V8.0.6软件中Box-Behnken试验设计方法，以均质压力（A）、均质次数（B）、菌液浓度（C）为试验因素，以蛋白破碎率为响应值设计三因素三水平响应面试验，并用方程对结果进行拟合及优化，各因素及水平见表1所示。

1.3 数据处理

单因素试验每个试验点做3次重复，使用Excel 2016处理数据及制作图表。响应面结果用Design Expert V8.0.6进行拟合，方差分析并优化参数。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果分析

2.1.1 不同均质压力对破碎结果的影响 由图1可知，在均质压力达到120 MPa之前，随着压力的增大，大肠杆菌蛋白破碎率明显升高，100 MPa和 120 MPa 处理之间差异达到显著水平（P<0.05）。当均质压力达到120 MPa之后，随着均质压力上升，大肠杆菌蛋白破碎率缓慢升高，但是处理之间差异不显著，说明压力达到120 MPa时，样品的破碎已经接近完成，升高压力对结果的影响已经不明显，因此，选用的均质压力为120 MPa。

2.1.2 不同均质次数对破碎结果的影响 由图2可知，样品破碎前期（次数≤3）增加均质次数可以显著提高大肠杆菌蛋白破碎率，处理之间差异达到显著水平（P<0.05）。但是均质3次之后，继续增加均质次数，结果的增加幅度明显放缓，均质3、4和5次处理之间差异均不显著。过长时间的破碎有可能导致释放出的蛋白质降解，并且考虑时间成本，选择的均质次数为3次。

2.1.3 不同菌液浓度对破碎结果的影响 由图3可知，随着菌液浓度的提高，大肠杆菌的蛋白破碎率呈缓慢下降的趋势，但各处理的结果基本维持在较高的水平（>9.5%），除了浓度最低的60 g/L处理，其他处理之间差异都不显著，说明菌液浓度对大肠杆菌蛋白破碎率的影响较小。因此，选取差异不显著的第1个处理，也就是80 g/L作为后续试验条件。

2.2 响应面试验结果分析

根据试验设计，一共安排响应面试验15组，试验顺序及结果如表2所示。通过软件对结果进行二元多次回归拟合，得到蛋白破碎率的回归方程为Y=11.55+0.82A+1.5B+0.18C-0.38AB-0.59AC+0.055BC+0.25A2-0.12B2+0.062C2。该回归方程模型的P模型=0.000 8<0.01，表明模型极显著;失拟项p失拟=0.155 4>0.05，表明模型失拟项不显著;模型的确定系数R2=0.9820，调整确定系数R2adj=0.949 5，说明该模型能解释94.95%的响应值变化，因此，该模型拟合良好，可以用此模型对最优破碎参数进行分析和预测。

从表3可知，一次项A、B达到极显著水平（P<0.01），而C不显著，表明均质压力和均质次数对蛋白破碎率影响极大，菌液浓度对蛋白破碎率的影响相对不显著。二次项中除了AC因素之间交互作用显著外，其他因素之间交互作用都不显著，表明因素之间的交互作用对蛋白破碎率的影响较小。而且各因素对大肠杆菌蛋白破碎率影响大小顺序为均质次数（B）>均质压力（A）>菌液浓度（C）。

通过观察两因素之间的响应曲面图可以预测变量的响应值以及确定变量之间的相互关系，响应面越陡，反映两因素之间的交互作用越显著[13]。三因素两两之间的响应面曲面见图4，可见图4-a的响应曲面较陡，表明均质压力和均质次数之间交互作用较显著，对蛋白破碎率的影响较大。图4-b、图4-c的响应曲面较平缓，表明均质压力与菌液浓度、均质次数与菌液浓度之间的交互作用较不显著，对响应值的影响较小。

2.3 最优参数的确定及验证

在选取的因素范围内，通过DesignExpert V8.0.6软件提取的最优条件：均质压力140 MPa、均质次数4次、菌液浓度60 g/L，在此条件下，回归模型预测的理论蛋白破碎率为14.04%。为了验证预测结果的可靠性，根据预测试验条件，经过3次重复，得到大肠杆菌实际蛋白破碎率为13.98%，这与预测值非常接近。说明该模型能较好地拟合实际情况，有一定的实践指导意义。

3 结论

本研究通过单因素试验，分析了均质压力、均质次数和菌液浓度3个因素对大肠杆菌蛋白破碎率的影响。然后根据单因素试验结果，利用响应面试验拟合出大肠杆菌蛋白破碎率的二元多次回归方程，各因素对大肠杆菌蛋白破碎率影响顺序为均质次数（B）>均质压力（A）>菌液浓度（C），并确定最优化的试验参数：均质压力140 MPa、均质次数4次、菌液浓度60 g/L，在此条件下的大肠杆菌实际蛋白破碎率为13.98%。该结果可为高压均质法破碎大肠杆菌，提取胞内外源蛋白提供一定的方法借鉴，并适用于大规模工业生产。

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