张清平 陈永旺 （福建医科大学附属泉州第一医院，泉州362000）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种系统性自身免疫性疾病，主要影响女性健康，可导致多个器官受损，最常累及肾脏［1］。狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）是SLE 常见并发症，是导致终末期SLE 患者肾脏疾病的主要原因之一［2］。LN 与SLE 发病率相关，可导致患者终末期肾病。IL-1β 是导致 LN 进展的关键分子，而 NLRP3 炎症小体激活可促进IL-1β 成熟与释放［3］。因此探寻新的干预方法调节NLRP3 炎症小体水平，可为LN 治疗提供新思路。

栀子苷是一类环烯醚萜苷类化合物，具有抗炎、镇痛、利胆、治疗软组织损伤及抑制胃液分泌和降低胰淀粉酶等作用［4］。研究显示，栀子苷可抑制哮喘小鼠气道炎症和高反应性［5］。CHEN 等［6］发现栀子苷可显著抑制骨关节炎大鼠的炎症因子水平。SLE 炎症级联中，NLRP3 炎症小体/IL-1β 信号通路发挥重要作用［7］。因此，炎症和自身免疫的关键作用引起广泛关注。激活NLRP3/ASC/Caspase-1 驱动LN 炎症小体，导致IL-1β 产生增加，是导致MLR/lpr小鼠肾脏损伤的主要原因，NLRP3 炎症小体激活促进LN进展［8-9］。但栀子苷是否通过调控NLRP3炎症小体发挥LN 保护功能尚未阐明。因此，本研究建立小鼠LN 模型，观察栀子苷对LN 的作用及分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂与仪器 抗Caspase-1 p20、IL-1β、Pro-caspase-1、ASC、GAPDH 抗体购自 Cell Signaling Technology 公司；抗 IL-18 抗体购自 Abcam 公司；抗Pro-IL-18 抗体购自 Proteintech 公司；抗 Pro-IL-1β 抗体购自Invitrogen 公司；栀子苷（纯度≥98%，货号：HY-N0010）购自MedChemExpress 公司；羧甲基纤维素钠（CMC-Na）购自国药集团化学试剂有限公司；HE 染色试剂盒购自北京海德创业公司；IL-1β、IL-18 ELISA 检测试剂盒购自上海蓝基生物公司；dsDNA 检测试剂盒购自上海广锐生物科技有限公司；shNLRP3慢病毒购自上海吉凯公司；全自动生化分析仪购自美国贝克曼库尔特公司；凝胶成像系统购自美国UVP公司。

1.1.2 实验动物 10周龄C57BL/6 雌性小鼠20只，体重（26.5±1.5）g，纯种10 周龄 MRL/lpr 雌性小鼠40 只，体重（26.5±1.6）g，均购自南京大学-南京生物医药研究院，合格证号：SCXK（苏）2017-0016。（23±1）℃、（55±5）%相对湿度，12 h 循环光照饲养，给予清洁级无菌垫料、饲料和饮水，自由摄食、饮水，严格遵照实验动物管理规范进行实验。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及处理 MRL/lpr 雌性小鼠随机分为模型组及治疗组，每组20只，模型组给予等剂量0.5%CMC-Na；治疗组灌胃给予栀子苷（200 mg/kg，溶于 0.5%CMC-Na 溶液）8 周［10］。20 只 C57BL/6 雌性小鼠作为对照组，给予等剂量0.5%CMC-Na。

1.2.2 尿蛋白检测 小鼠出生12周时采用代谢笼搭配粪尿分离漏斗收集尿液，每2 周分别留取模型组及治疗组小鼠尿液至20周，所有尿液标本采用双蒸水稀释10 倍，按照BCA 试剂盒说明书检测样本蛋白含量。分别加入样本和标准品，加入BCA 工作液 200 μl，37℃ 孵育 30 min。酶标仪测定562 nm 处吸光度（A），根据标准品计算样品蛋白浓度。

1.2.3 BUN 和Cr 水平检测 小鼠治疗8 周后取静脉血，3 000/rmin离心10 min，取上清，AU5800全自动生化分析仪检测各组小鼠BUN和Cr水平。

1.2.4 肾脏组织病理形态学观察 取各组小鼠肾组织，常规冲洗，多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色，显微镜下观察肾脏组织炎症浸润情况。

1.2.5 ELISA 检测各组小鼠血清抗dsDNA、IL-1β、IL-18 含量 取各组小鼠静脉血，3 000/rmin 离心10 min，取上清。按试剂盒说明书配制梯度标准品与检测试剂，100 μ/l孔加入样品或对照品4℃孵育过夜，洗板，加入检测抗体 100 μl 室温孵育 1 h，洗板，加入HRP-Streptavidin 工作液室温孵育45 min，洗板，加入TMB 显色液室温孵育30 min，洗板，50 μ/l孔加入终止液，450 nm 处读数，绘制标准曲线，计算样品浓度，各样品重复2次。

1.2.6 免疫荧光检测各组肾脏IgG 沉积情况 腹腔注射过量3%戊巴比妥钠处死小鼠，取肾脏组织冰冻切片，滴加含10%山羊血清的PBS 室温封闭1 h，弃血清，滴加Alexa Fluor-546 标记的IgG 抗体，放入湿盒中，37℃ 孵育30 min，PBS 冲洗，5 min×3 次，避光下甘油封片，荧光显微镜下观察并拍照，Image Pro Plus 6.0 软件进行荧光强度分析。

1.2.7 Western blot 检测 取各组肾组织200 mg，加入裂解液1 ml，匀浆裂解，4℃、8 000/rmin 离心15 min，取上清，定量，50 μg/孔上样，10%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，电转至PVDF 膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗（Caspase-1 p20、IL-1β、IL-18、Pro-caspase-1、ASC、GAPDH）4℃ 过夜，加辣根过氧过酶标记二抗（1∶1 000）室温1 h，ECL 化学发光法显色，凝胶成像系统对分析条带。

1.2.8 NLRP3 基因沉默 小鼠尾静脉分别注射滴度 为 1×108ml-1的 NLRP3 shRNA 和 shRNA 慢 病 毒500 μl，沉默NLRP3基因表达，48 h后可达到敲低效果，同时给予栀子苷处理8周。

1.3 统计学分析 采用SPSS18.0 软件分析数据。计量资料以表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠尿蛋白含量 模型组小鼠尿蛋白含量呈时间依赖性升高（P<0.05），给予栀子苷治疗后16周后尿蛋白含量较模型组显著降低（P<0.05，表1）。

表1 各组小鼠各时间点尿蛋白水平（，n=20）Tab.1 Urine protein levels at each time point of mice in each groups（，n=20）

表1 各组小鼠各时间点尿蛋白水平（，n=20）Tab.1 Urine protein levels at each time point of mice in each groups（，n=20）

Note：Compared with Control，1）P<0.05；compared with Model，2）P<0.05.

Urine protein levels Groups 20 weeks 1.04±0.03 3.48±0.261）1.95±0.141）2）16 weeks 1.06±0.03 2.62±0.211）2.21±0.151）2）12 weeks 1.02±0.03 1.82±0.151）1.81±0.101）14 weeks 1.05±0.04 1.95±0.181）1.93±0.121）18 weeks 1.03±0.05 2.93±0.251）2.04±0.161）2）Control Model Treatment

2.2 各组小鼠BUN、CRE、抗dsDNA 水平 与对照组相比，模型组小鼠血清BUN、CRE 及抗dsDNA 水平显著升高（P<0.05），给予栀子苷治疗后，血清抗BUN、CRE、抗dsDNA 水平增加得到明显缓解，说明栀子苷可减轻小鼠肾脏损伤（图1）。

图1 各组小鼠血清BUN、CRE、抗dsDNA水平Fig.1 Serum BUN，CRE and anti-dsDNA levels of mice in each group

2.2 HE 染色观察小鼠肾脏组织病理学形态 与对照组相比，模型组小鼠肾小球增生、肾小球硬化及肾小球周围炎症明显加重，给予栀子苷治疗后，小鼠肾脏病理学改变得到明显缓解（图2）。

图2 各组小鼠肾脏组织HE染色（×400）Fig.2 Renal tissues HE staining of mice in each group（×400）

2.3 小鼠肾脏组织IgG 沉积情况及血清抗dsDNA水平 与对照组相比，模型组小鼠肾小球出现大量IgG免疫复合物沉积，荧光强度明显增强（图3A），给予栀子苷治疗后，小鼠肾小球免疫复合物沉积情况缓解（P<0.05，图3B）。

图3 各组小鼠肾脏组织IgG荧光染色Fig.3 IgG fluorescent staining in renal tissues of mice in each group

2.4 栀子苷对LN 小鼠NLRP3 炎症小体激活的影响 模型组小鼠NLRP3 炎症小体及其下游ASC 和Pro-caspase-1 表达明显上调，给予栀子苷治疗后，小鼠肾脏组织NLRP3 炎症小体及其下游ASC 和Pro⁃caspase-1 表达明显降低（P<0.05，图4A）。ELISA 分析各组小鼠血清IL-1β 和IL-18 产生情况，栀子苷治疗组小鼠血清IL-1β和IL-18水平较模型组明显降低，说明栀子苷治疗后MRL/lpr小鼠炎症缓解（图4B）。

图4 各组小鼠肾脏组织中NLRP3炎症小体激活情况Fig.4 Activation of NLRP3 inflammasome in renal tis⁃sues of mice in each group

2.5 栀子苷通过NLRP3炎症小体影响炎症反应 Western blot 结果显示，与 shRNA 组相比，shNLRP3处理后，小鼠肾组织NLRP3 蛋白表达明显下调（P<0.05，图5A）。与对照组相比，模型组肾组织Procaspase-1、Caspase-1p20、IL-1β 和 IL-18 表达明显升高，沉默NLRP3 及栀子苷治疗的MRL/lpr 小鼠中，Caspase-1p20、IL-1β 和 IL-18 表达较模型组明显降低（P<0.05，图5B），两组间炎症反应差异无统计学意义（P>0.05），提示栀子苷通过调控NLRP3抑制狼疮肾组织炎症反应。Pro-IL-1β、Pro-IL18 表达改变与前者相反，提示栀子苷激活NLRP3 炎症小体后导致IL活化增加，IL前体被大量消耗。

图5 肾组织中 Pro-caspase-1，Caspase-1p20，IL-1β，Pro-IL-1β，Pro-IL-18和IL-18蛋白表达Fig.5 Expressions of Pro-caspase-1，Caspase-1p20，IL-1β，Pro-IL-1β，Pro-IL-18 and IL-18 proteins in re⁃nal tissues

2.6 栀子苷通过NLRP3 影响肾脏病理变化 与对照组相比，HE染色下模型组小鼠肾小球增生、肾小球硬化，肾小球周围炎症明显加重，沉默NLRP3，治疗组小鼠病理缓解程度与栀子苷组无明显差异（图6）。

图6 沉默NLRP3后各组肾组织HE染色（×200）Fig.6 HE staining of renal tissues after NLRP3 silencing（×200）

2.7 栀子苷通过NLRP3 影响小鼠BUN、CRE、抗dsDNA 水平 与对照组相比，模型组小鼠血清BUN、CRE 及抗dsDNA 水平明显提高（P<0.05），沉默NLRP3 及栀子苷治疗的MRL/lpr 小鼠血清抗BUN、CRE 及抗dsDNA 水平上升得到明显缓解，且两组间炎症反应差异无统计学意义（P>0.05，图7），提示栀子苷通过调控NLRP3 抑制狼疮肾组织炎症反应。

图7 沉默NLRP3 后各组小鼠血清BUN，CRE，抗dsDNA水平Fig.7 Serum BUN，CRE and anti-dsDNA levels after NL⁃RP3 silencing of mice in each group

3 讨论

尽管现有治疗方法对LN 患者预后有所改善，但LN仍是导致SLE患者肾功能衰竭的主要原因［11］。目前LN 治疗药物主要为糖皮质激素和免疫抑制剂，但效果并不理想［12］。因此，开发LN 治疗的新策略迫在眉睫。本研究证明栀子苷治疗可改善MRL/lpr小鼠LN损伤，小鼠尿蛋白评分、BUN、CRE、抗ds⁃DNA 水平显著降低，肾小球免疫复合物沉积显著减轻。进一步探讨栀子苷作用机制发现，栀子苷可显著抑制NLRP3 炎症小体激活，减少下游炎症细胞因子 IL-18 和 IL-1β 产生与释放。NLRP3 炎症小体激活是导致LN 进展的主要原因之一。研究表明，NL⁃RP3 炎症小体激活可导致IL-18 和IL-1β 产生与释放［13］。目前认为IL-18在LN患者血液和肾组织中表达升高，且与LN严重程度呈正相关，升高的IL-18可激活肾组织中的T细胞，促进炎症反应，加重肾脏损伤［14-15］。研究表明，IL-1β 有助于新月形成和炎症细胞招募［16］。除 NLRP3 外，Caspase-1 在 LN 小鼠中也发挥重要作用。研究表明，Caspase-1 缺陷型小鼠可减缓LN 发生发展，通过抑制P2X7 受体抑制NLRP3和Caspase-1 激活，发挥保护作用［17］。本研究发现，MRL/lpr 小鼠肾脏 NLRP3 炎症小体（NLRP3/ASC/Caspase-1）被激活，栀子苷治疗可抑制NLRP3 炎症小体激活及IL-1β 和IL-18 产生，表明栀子苷通过抑制NLRP3 活化治疗LN。进一步研究NLRP3 炎症小体是否是栀子苷治疗LN 的特异靶标，沉默MRL/lpr小鼠 NLRP3 基因表达，结果显示，shNLRP3 组 NL⁃RP3 炎症小体活化被抑制，IL-1β/IL-18 产生减少。同时，栀子苷处理组IL-1β 和IL-18 表达与shNLRP3组相同，表明沉默NLRP3 基因废除栀子苷对LN 小鼠的保护作用，证实NLRP3 炎症小体在LN 发病机制中的作用，为靶向干预NLRP3 治疗LN 提供依据。大量文献表明免疫复合物可激活NLRP3 炎症小体，而SLE 中巨噬细胞对先天免疫刺激反应过度，导致炎症小体活化增强，炎症细胞因子产生是导致疾病发生发展的重要机制。多种小鼠模型研究表明，NLRP3 炎症小体在介导LN 中发挥重要作用。Cas⁃pase-1 是炎症小体的中心酶，在SLE 模型中对Ⅰ型干扰素反应、自身抗体产生和肾炎发生发展起重要作用［18］。研究表明，栀子苷可抑制小鼠巨噬细胞和小鼠模型炎症反应［19］。因此，栀子苷可能通过影响巨噬细胞炎症反映干预NLRP3 炎症小体激活，从而减轻LN 肾损伤。栀子苷已被证明具有多种生物学效应，提取自茜草科植物栀子的干燥成熟果实，其作为药物相对安全，具有开发治疗LN 药物的潜能［4］。

综上所述，栀子苷可通过抑制NALP3 炎症小体激活抑制炎症细胞浸润、炎症因子产生，减轻LN 肾损伤，改善小鼠预后。本研究显示，栀子苷可缓解LN小鼠肾脏损伤，为LN治疗提供了新思路，并揭示了其潜在分子机制，为栀子苷临床应用提供基础。