李梦俊 张晓荣 王 婧 高艳萍 （山西医科大学汾阳学院，汾阳032200）

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是一种在自然界中普遍存在的革兰氏阴性微需氧细菌，在全世界50%以上人口的肠道内定植，其感染胃窦上皮区并持续很长时间［1］。有研究表明，Hp 已经发展出复杂的形态特点来扩大胃黏膜的炎症程度，如螺旋形，鞭毛运动，趋化，和生产脲酶中和胃的酸性环境［2］。有来自细菌和宿主的多种因素参与了这些复杂的相互作用。另一方面，为了建立持久性感染，Hp通过模仿宿主抗原来逃避免疫系统，这种病原体有躲避免疫系统的能力，然后以宿主细胞的形式存在，从而导致免疫耐受［2-4］。此外，Hp 还具有多种基因，这些基因可能从寄主处获取营养以在寄主体内存活更长时间，Hp 的持续存在会引起慢性炎症，并可能增加慢性疾病的发生发展［3］。本研究发现，Hp的持续存在可能会造成骨骼肌衰减。

IL-1β 是区域性和全身性炎症的主要刺激因子，是一种主要的促炎症介质，可诱导基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）和具有血小板反应蛋白基序的去整合素和金属蛋白酶产生，可能导致关节软骨中胶原Ⅱ和蛋白多糖下调［5］。此外，IL-1β 刺激的骨骼肌细胞可激活环氧合酶-2（cy⁃clooxygenase-2，COX-2）和诱导型一氧化氮合酶（in⁃ducible nitric oxide synthase，iNOS）表达，触发前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和一氧化氮（nitric ox⁃ide，NO）释放，引起慢性炎症，诱发骨骼肌衰减［6］。

Hp感染率随着年龄的增长而增加，可引起全身性炎症反应，ZEMBROŃ-ŁACNYA 等［7］发现，肌肉减少症（以下简称“肌少症”）者的血清炎症因子水平升高，通过抑制炎症患者肌肉质量及力量均有明显改善。2010 年老年肌少症欧洲工作组（European Working Group on sarcopenia in older people，EWGSOP）［8］和 2011 年 国 际 肌 少 症 会 议 工 作 组（International Sarcopenia Conference Working Group，ISCCWG）［9］进一步将肌少症定义为“一种广泛的、渐进性的骨骼肌量和肌力丧失，伴有身体活动障碍、生活质量降低等不良后果风险的综合征”。有研究表明，在骨骼肌生成过程中，有3个起重要调控作用的转录因子家族：配对盒蛋白（paired box，PAX）家族、同源异形框基因（sine oculis homeobox，SIX）家族和生肌调节因子（myogenic regulatory factors，MRFs）家族，其中MRFs 在细胞成肌决定及终末分化阶段起主要作用［10］。MRFs转录因子家族有4个成员：肌肉分化因子 1（myogenic differentiation 1，MYOD1）、生肌决定因子5（myogenesis determining factor 5，MYF5）、MYF6 和肌细胞生成素（myogenin，MYOG）。MYOD1是肌肉组织特异的转录因子，在肌细胞分化中起重要作用；MYOG 是成肌细胞终末分化阶段的核心调控因子，作为分化调控因子参与成肌细胞的终末分化阶段，当MYOD1 或MYOG 表达下降时，肌细胞分化过程受阻，导致骨骼肌衰减，最终引起肌少症［11］。因此，骨骼肌衰减的诊断成为防治肌少症的突破点，以便实现肌少症的早发现、早诊断、早治疗，提高老年人生存质量，减少医疗资源的消耗，减轻社会负担。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与菌株 体重28～32 g 的雄性8 月龄C57BL/6 小鼠购自山西医科大学动物饲养室，生产许可证号：SCXK（晋）2015-0001。实验小鼠在25℃、相对湿度60%、通风良好的环境下，每天给予充足的水分和食物饲养8个月。

1.1.2 实验试剂 ELISA 试剂盒购自上海西唐科技有限公司；pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG 抗体购自ABclonal 公司和博士德生物公司；免疫组化试剂盒购自博士德生物公司；BeyoRTTMⅡcDNA第一链合成试剂盒购自碧云天生物公司；SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒购自天根生物公司；pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG 引物购自上海生工生物公司，引物序列分别为 pNF-κB（F：5'-CTGAAAAGCACCTGACAAAAGA-3'，R：5'-CTGTGTAGCCATCTGTTGAGTT-3'）、IL-1β（F：5'-TCGCAGCAGCACATCAACAAGAG-3'，R：5'-AGGTCCACGGGAAAGA⁃CACAGG-3'）、MYOD1（F：5'-CGCCATCCGCTATATCGAGG-3'，R：5'-CTGTAGTCCATCATGCCGTCG-3'）、MYOG（F：5'-AGTGCCATCCAGTACATCGAG-3'，R：5'-AGGTTGTGGGCATCTGTAGG-3'）、β-actin（F：5'-GCCAACCGCGAGAAGATGA-3'，R：5'-CAT⁃CACGATGCCAGTGGTA-3'）。

1.2 方法

1.2.1 物理方法测量小鼠的握力水平 简易握力计（100 N）一端固定，另一端系在小鼠尾巴根部，诱导小鼠四肢紧抓铁网做攀爬动作，同时记录握力计变化，每只小鼠测量5次取平均值。

1.2.2 Hp复苏及菌液制备 哥伦比亚固体培养基结合脱脂纤维羊血及混合抗生素制成血平板，细菌室温融化后取50 μl 接种至制好的血平板，在37℃、5%O2、10%CO2、85%N2的环境下培养7～10 d，待细菌长满（无色透明，针尖样细小或融合成片，表面光滑湿润）部分收集至1.5 ml EP 管，存于-80℃备用；部分用无菌生理盐水刮取制成新鲜Hp 悬液用于小鼠灌胃处理。

1.2.3 小鼠灌胃及处理 将24 只小鼠平均分为4 组：对照组（M）、低浓度组（L）、中浓度组（I）、高浓度组（H），6 只/组，对照组用生理盐水处理，浓度组分别用低浓度0.3 ml、中浓度0.6 ml、高浓度0.9 ml Hp 悬液（菌液浓度调至1×109CFU/ml）处理。连续灌胃3 周，每周1 次，距最后1 次灌胃10 周后麻醉小鼠，取小鼠新鲜血液存于-80℃备用，取胃组织、腓肠肌组织、比目鱼肌组织部分存于-80℃备用，部分于4%多聚甲醛液中固定。

1.2.4 ELISA 检测IL-1β 根据双抗体夹心法检测小鼠血清中IL-1β 表达，每孔加入标准品或待测样品100 μl，将反应板充分混匀后于37℃静置40 min；洗涤液充分洗涤4～6次，晾干；每孔加入蒸馏水和第一抗体工作液各50 μ（l空白除外），反应板充分混匀后于37℃静置20 min；洗板，同前；每孔加入酶标抗体工作液100 μl，反应板于37℃静置10 min；洗板，同前；每孔加入底物工作液100 μl，置于37℃避光反应15 min；每孔加入100 μl终止液混匀，酶标仪检测450 nm处的吸光度（OD）值。

1.2.5 HE 染色 石蜡切片于65℃烤箱烤片2 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各20 min，乙醇梯度脱水，蒸馏水冲洗2 次；苏木素染色1～2 min，1%盐酸乙醇分化1 min，蒸馏水冲洗2 次，稀氨水蓝化数秒；伊红染色1～2 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片。

1.2.6 免疫组化 石蜡切片于65℃烤箱烤片2 h，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡各20 min，乙醇梯度脱水，蒸馏水冲洗2次；滴加2%的H2O2，阻断内源性的H2O2酶，室温孵育10 min，蒸馏水冲洗3 次，再用PBS 缓冲液冲洗2次，甩去多余的液体；采用枸橼酸盐进行抗原修复，湿盒中孵一抗，4℃ 过夜，PBS 缓冲液冲洗3 次，甩去多余的液体，接着孵二抗，37℃孵育30 min；DAB 显色，苏木素染色1～2 min，1%盐酸乙醇分化1 min，自来水冲洗后返蓝数秒，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，最后中性树胶封片。

1.2.7 qPCR 检测 pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG的mRNA 表达 取30 mg 小鼠肌肉组织，加入1 ml Trizol 裂解液超声破碎组织提取总RNA，酶标仪检测总 RNA 浓度（ng/μl）。BeyoRTTMⅡcDNA 第一链合成试剂盒配制逆转录反应体系，42℃孵育60 min，80℃ 孵育 10 min。SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒配置PCR 反应体系，95℃预变性15 min，95℃ 变性10 s，60℃ 退火/延伸30 s，PCR反应循环40次。

1.2.8 Western blot 检测 pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG 蛋白质表达 取30 mg 小鼠肌肉组织，加入含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的细胞裂解液超声破碎组织提取总蛋白，BCA 试剂盒对蛋白定量，按照40 μg/孔的蛋白量进行12%的SDS-PAGE，蛋白分离后转至NC 膜，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，加入相应的一抗4℃过夜，使用TBST 洗膜后，加入二抗室温孵育2 h，TBST 洗膜，最后加入发光液于凝胶成像仪曝光拍照并统计灰度值计算相关蛋白的相对表达量。

1.3 统计学处理 数据分析采用SPSS24.0统计软件，组间比较采用单因素方差分析。应用GraphPad Prism8.0 软件进行t检验分析及统计图形制作。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠的握力水平 与对照组相比，干预组小鼠的握力明显下降，且随着Hp 悬液浓度的增加，小鼠握力逐渐下降，呈负相关（P<0.05、P<0.01 或P<0.001，图1）。

图1 物理方法测量小鼠的握力水平Fig.1 Grip strength of mice was measured by physical method

2.2 ELISA检测小鼠血清中IL-1β表达量 采用鼠源IL-1β ELISA 试剂盒以空白孔调零检测其450 nm处的OD 值测量表达量，结果显示IL-1β 在低浓度组（L）、中浓度组（I）、高浓度组（H）表达量明显高于对照组（M）（P<0.01或P<0.001），表明Hp干预小鼠一定时间后血清中的IL-1β明显升高（图2）。

图2 ELISA检测小鼠血清中IL-1β表达量Fig.2 Levels of serum IL-1β of mice was detected by ELISA

2.3 HE 染色观察小鼠胃黏膜、小鼠腓肠肌组织、小鼠比目鱼肌组织的炎症浸润程度及小鼠骨骼肌变化情况 与对照组相比，随着菌液浓度增加，小鼠胃黏膜组织炎症浸润程度逐渐增加（图3A）；小鼠腓肠肌组织炎症浸润程度增加，高浓度组出现玻璃样变性，肌肉组织有衰减的表现（图3B）；小鼠比目鱼肌组织炎症浸润程度增加，肌肉组织有衰减表现（图3C）。

图3 各组小鼠HE染色结果（×200）Fig.3 Results of HE staining of mice in each group（×200）

2.4 免疫组化检测骨骼肌组织中IL-1β、MYOG 的表达 与对照组相比，干预组（高浓度菌液组，因为高浓度菌液组对小鼠骨骼肌组织的影响变化最明显）IL-1β 在骨骼肌组织中的表达明显增加，MYOG在骨骼肌组织中的表达明显减少（P<0.001）；图4A中深棕色信号分别代表IL-1β 和MYOG 的阳性信号，浅棕色为背景颜色，图 4B 为 IL-1β 和 MYOG 的阳性信号百分比的统计分析柱状图。

图4 免疫组化检测骨骼肌组织中IL-1β、MYOG表达（×200）Fig.4 Expressions of IL-1β and MYOG in skeletal mus⁃cle tissue detected by immunohistochemistry（×200）

2.5 qPCR 检测小鼠肌肉组织中 pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG 的 mRNA 表达 与对照组相比，pNF-κB、IL-1β 表达量随着菌液浓度的升高而增加，MYOD1、MYOG 表达量随着菌液的浓度的升高而减少（P<0.01或P<0.001）。见图5。

图5 qPCR检测小鼠肌肉组织中pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG的相对表达Fig.5 qPCR analysis of pNF-κB，IL-1β，MYOD1 and MYOG relative expressions in mice muscle tissue

2.6 Western blot 检测小鼠肌肉组织中pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG 的表达 如图6 所示，与对照组相比，小鼠腓肠肌组织及比目鱼肌组织中pNF-κB、IL-1β 蛋白的表达随着菌液浓度的升高而增加，MYOD1、MYOG 表达量随着菌液的浓度的升高而减少（P<0.05、P<0.01或P<0.001）。

图6 Western blot 检测小鼠肌肉组织中 pNF-κB、IL-1β、MYOD1、MYOG相对表达Fig.6 Western blot analysis of pNF-κB，IL-1β，MYOD1 and MYOG relative expression in mouse muscle tissue

3 讨论

Hp是一种普遍存在的物种，在全世界50%以上人口的肠道内定植［1］。在过去的20 年中，已经建立了Hp 感染的实验模型来研究疾病的发病机制，使用小鼠适应的Hp 菌株（Sidney 菌株，SS1），LEE 等［12］建立了小鼠长期高细菌定植模型。虽然Hp 被认为是非侵入性的，但由于感染，会在胃黏膜中引起广泛的炎症反应，这种反应的特点是炎症细胞，特别是中性粒细胞的黏膜浸润，其主要由促炎性趋化因子如IL-1β 增强表达介导［13-15］。本研究结果证实，Hp 感染导致小鼠血清中的炎症因子增加，尤其是IL-1β的表达量增加更明显，同时还能激活NF-κB炎症通路，经过信号级联反应，又会反过来增加IL-1β的表达。

骨骼肌的生成是一个非常复杂的基因调控网络。一些转录因子如PAX3、PAX7、SIX1、SIX4 等是决定成肌祖细胞定向分化的关键上游调控因子，而成肌祖细胞的生肌决定及终末分化则由MRFs 调控［11］。在骨骼肌的生成过程中，有3 个起重要调控作用的转录因子家族：PAX 家族、SIX 家族和MRFs家族。其中PAX家族蛋白和SIX家族蛋白在肌生成早、中期起主要作用，随后表达量下降，MRFs 在细胞成肌决定及终末分化阶段起主要作用［11］。在肌肉发育过程中，骨骼肌生成的决定阶段和终末分化阶段由MRFs转录因子严格调控。早在28年前就有研究表明MRFs 家族成员作为碱性-螺旋-环-螺旋转录因子，在非肌源性细胞中过表达时可启动肌生成过程，促进细胞向成熟转化及细胞的分化［16］。MYOD1 和MYOG 是成肌细胞终末分化阶段的核心调控因子，对于骨骼肌的生成具有双重调控作用，一方面作为分化调控因子参与成肌细胞的终末分化阶段，另一方面也作为生肌决定因子参与成肌细胞的生肌过程［11］。本实验通过免疫组化、qPCR、Western blot 3种方法检测了骨骼肌组织中肌肉分化相关蛋白MYOD1 和MYOG 的表达伴随着炎症浸润程度的增加而减少，从而抑制肌肉细胞的分化，引起骨骼肌衰减。

综上所述，本研究发现Hp 感染C57BL 小鼠可能通过介导IL-1β 导致骨骼肌衰减，其具体机制还需后期通过基因敲除和细胞实验继续验证。但这一发现可为骨骼肌衰减的治疗及预防提供新的思路。