杨 慧 李 浩 冯立爽 杨卓东 杨 煜

（吉林大学公共卫生学院预防医学实验教学中心，长春130021）

皮肤作为人体最大的一个器官，是抵御外界刺激的第一道防线。在过去的30年中，各类皮肤炎症疾病以及皮肤癌的发病率一直在不断增加［1］。流行病学研究表明，UV 辐射仍然是皮肤癌最重要的可干预风险因素［2］。太阳紫外线辐射（UV）可分为UVA（315～400 nm），UVB（280～315 nm）和 UVC（100～280 nm）。UVB 辐射是导致皮肤癌的主要危险因素［3］。过量的UVB 暴露会破坏体内生物大分子，包括蛋白质、脂质和核酸，使细胞产生自由基，发生氧化应激、凋亡等反应，最终导致皮肤炎症性疾病、皮肤癌等［4-6］。然而，UVB 是否通过影响免疫系统介导皮肤损伤还未明确。

Toll 样受体（Toll-like receptors，TLR）是参与非特异性免疫（天然免疫）的一类重要蛋白质分子，主要表达在免疫细胞上，通过识别多种病原微生物进化中的保守分子如酵母多糖、脂多糖、肽聚糖等，激活细胞内信号传递，介导天然免疫，也是连接非特异性免疫和特异性免疫的桥梁。目前已发现11 种TLR（TLR1～11）。有研究表明，TLR2 和 TLR4 参与多种皮肤疾病的发生发展，并且皮肤炎症性疾病中TLR2、TLR4的表达升高，但其是否参与UVB诱导的皮肤炎症性疾病并不清楚［5］。研究显示皮肤角质形成细胞如HaCaT 中也可表达TLR2 和TLR4，因此是否是皮肤角质形成细胞本身，而非免疫细胞中表达的TLR2 或TLR4 参与UVB 诱导的皮肤损伤并不清楚。内质网应激是细胞为应对内质网腔内错误折叠与未折叠蛋白聚集以及钙离子平衡紊乱等状况，而激活未折叠蛋白反应、内质网超负荷反应和cas⁃pase 介导的凋亡通路等信号途径的反应过程［7］。TLRs 激活或内质网应激被诱导所产生的信号可以相互融合，促进病理炎症反应，损伤皮肤角质细胞并最终可引起细胞凋亡，但目前TLR 信号和内质网应激相互作用的机制尚不清楚［8］。C29是TLR2 抑制剂，TAK-242 是TLR4 抑制剂，二者可有效阻断这2 个受体相关的信号通路，因此常采用2 种抑制剂，阻断相应的信号传导通路用于各种研究工作。

本文拟利用C29和TAK-242 探讨阻断TLR2 和TLR4 能否缓解UVB 导致的HaCaT 细胞损伤作用并分析内质网应激的变化，探究TLR2 和TLR4 在UVB所致的细胞损伤中的作用。为预防及治疗UVB 引起的皮肤疾病提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 人永生化角质形成细胞（human immor⁃tal keratinocyte，HaCaT）购自中科院上海细胞库。C29、TAK-242（MCE 中国皓元生物公司）；一抗Cas⁃pase8、NF-κB、p-NF-κB、PERK、P-PERK、IRE1α（美国CST 公司）；GAPDH（北京博奥森公司）；山羊抗兔、鼠（北京鼎国昌盛公司）。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT 细胞培养 含10%胎牛血清（BI，以色列）的DMEM 培养基培养HaCaT 细胞，将细胞置于37℃，5%CO2恒温培养箱中。每隔48 h 更换培养基，待细胞融合至80%左右时，进行消化传代。

1.2.2 细胞分组及处理 正常组：正常培养的Ha⁃CaT 细胞；UVB 组：细胞给予 UVB 照射处理；UVB+C29组：细胞给予 C29预处理 2 h 后，给予 UVB 照射；UVB+TAK-242组：细胞给予TAK-242预处理2 h后，给予UVB照射；UVB+C29+TAK-242组：细胞给予C29和TAK-242预处理2 h后，再给予UVB照射。

1.2.3 UVB 照射HaCaT 细胞 取对数生长期的HaCaT 细胞，3×103个/孔细胞接种 96 孔板，每组设置6个复孔，分别照射不同时间：30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s、210 s、240 s，照射时将培养皿盖子打开置于紫外线灯下，培养皿距离灯源约20 cm，总辐射剂量30 mJ/cm2。

1.2.4 MTT 法检测HaCaT 细胞存活率 取对数生长期的HaCaT 细胞，3×103个/孔细胞接种于96 孔板，每组各设置6个复孔，根据细胞不同分组进行不同处理。然后根据MTT 试剂盒使用说明书进行操作，每孔加入10 μl MTT（5 g/L），置于37℃ 孵育4 h，弃培养基，每孔加入150 μl DMSO，振动5 min 后，使用酶标仪测量反应溶液在490 nm 处的吸光度值。根据说明书给出的公式计算细胞存活率。细胞存活率=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%（As 为实验组吸光度值、Ab为空白组吸光度值、Ac为对照组吸光度值）。

1.2.5 TLR2、TLR4 抑制剂 C29和 TAK-242 处理 Ha⁃CaT细胞 取对数生长期的HaCaT细胞，3×103个/孔细胞接种96 孔板，每组设置6 个复孔，待细胞贴壁后分别给予含 5 μmo/lL、10 μmo/lL、25 μmo/lL、50 μmo/lL、75 μmo/lL、100 μmo/lL、150 μmo/lL、200 μmo/lL、250 μmo/lL 浓度的 C29和 0 μmo/lL、0.01 μmo/lL、0.1 μmo/lL、1 μmo/lL、2 μmo/lL、5 μmo/lL、10 μmo/lL、12 μmo/lL、15 μmo/lL、20 μmo/lL 浓度的 TAK-242（培养基培养 2 h，根据MTT试剂盒使用说明书进行操作，置于37℃，5%CO2培养箱中孵育2 h，使用酶标仪测定反应溶液在490 nm 处的吸光度值，计算细胞存活率。细胞存活率=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%（As 为实验组吸光度值、Ab为空白组吸光度值、Ac为对照组吸光度值）。

1.2.6 Western blot 法检测蛋白表达 弃掉培养皿的培养液，用PBS 缓冲液清洗细胞2 遍，然后用0.25%胰蛋白酶将细胞消化并转移到EP管中，加入适量的培养液1 000/rmin，5 min离心；弃掉上清，加入适量 PBS 缓冲液重悬细胞，2 000/rmin，5 min 离心；重复此步骤2 次；每管细胞中加入200 μl 的RIPA 裂解液，然后用量程为200 μl的枪头小心将细胞重悬，冰上裂解30 min，每5 min 振荡1 次；裂解完毕后，4℃，12 000/rmin，离心5 min；吸取上清至准备好的另一新EP 管，4℃存放、准备BCA 蛋白定量；将标准蛋白BCA 按照试剂说明书配制成浓度为25 mg/ml 的标准蛋白母液，然后准确吸取3 μl 标准蛋白母液、147 μl 的 RIPA 裂解液，将标准蛋白母液稀释成浓度为0.5 mg/ml。稀释标准蛋白，取待测样品，进行蛋白定量。然后按照Western blot常规测定方法，进行蛋白电泳、转膜、显影。分别加入一抗Caspase-8（兔抗人 1∶1 000 倍稀释）、NF-κB（鼠抗人1∶1 000倍稀释）、p-NF-κB（鼠抗人1∶1 000倍稀释）、PERK（兔抗1∶1 000倍稀释）、P-PERK（兔抗1∶1 000倍稀释）和IRE1α（兔多抗1∶500 倍稀释）的表达，内参选择 GAPDH（兔抗人1∶2 000 倍稀释），二抗为HRP 标记的山羊抗兔、鼠（1∶1 000 倍稀释），通过ECL 发光显影检测，并通过Image J 软件进行蛋白灰度值测定。

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0软件对数据进行统计学分析，计量资料采用表示，多组之间进行比较采用单因素方差分析ANOVA，两两比较采用SNK法，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 UVB 最佳照射时间的确定 为了确定UVB 照射造成HaCaT 细胞损伤作用的最佳时间，采用MTT法检测细胞存活率，结果显示随着UVB 照射时间的延长，HaCaT 细胞的存活率逐渐降低，UVB 照射时间为 22.5 s、45.0 s、67.5 s 组 HaCaT 细胞的存活率与正常组比较差异无统计学意义（P>0.05）；UVB 照射 时 间为 90 s、112.5 s、135 s、157.5 s、180 s 和202.5 s组HaCaT 细胞的存活率显著低于正常组，具有统计学意义（P<0.05），因此本研究选取90 s 作为该实验的UVB照射时间。见图1。

图1 MTT 法测定UVB 照射不同时间后HaCaT 细胞的存活率Fig.1 MTT assay was used to determine survival rate of HaCaT cells for different UVB exposure time

2.2 TLR2和TLR4在UVB致HaCaT损伤中的作用

2.2.1 TLR2 抑 制 剂 C29对 UVB 致 HaCaT 损 伤 的影响 采用浓度分别为 10 μmol/L、25 μmol/L、50 μmo/lL、75 μmo/lL 和 100 μmo/lL 的 C29处 理HaCaT 细胞2 h后，经UVB 照射，各组细胞存活率均低于正常组，差异具有统计学意义（P<0.05），除正常组外，150 μmo/lL、200 μmo/lL 和 250 μmo/lL 的C29处理 细胞后，经UVB 照射，HaCaT 细胞存活率均高于其他各浓度组，差异具有统计学意义（P<0.05）。C29150 μmo/lL 浓度处理的 HaCaT 细胞，经UVB 照射后，其存活率达103.0%，提示随着C29浓度的增加，通过抑制TLR2 可逐渐恢复UVB 造成的细胞损伤，其中150 μmo/lL 时可恢复至正常水平，可能由于抑制剂的毒性作用导致细胞损伤，因此确定150 μmo/lL为本实验的最佳处理浓度。见图2。

图2 MTT法测定不同浓度C29处理后HaCaT细胞的存活率Fig.2 MTT assay was used to determine survival rate of HaCaT cells treated with different concentrations of C29

2.2.2 TLR4抑制剂TAK-242对UVB致HaCaT损伤的影响 采用浓度分别为0.01 μmo/lL、0.1 μmo/lL、1 μmo/lL、2 μmo/lL、5 μmo/lL、10 μmo/lL、12 μmo/lL、15 μmo/lL 和 20 μmo/lL 的 TAK-242 处理 HaCaT 细胞2 h后，经UVB 照射，结果显示HaCaT 细胞的存活率随 TAK-242 浓度增加而增加，在 2 μmo/lL 时 Ha⁃CaT 细胞的存活率达到最大为98.9%，随着TAK-242 浓度的增加，HaCaT 细胞的存活率降低，可能是由于抑制剂浓度过高导致的毒性作用。TAK-242 2 μmo/lL 时的HaCaT 细胞存活率均高于其他浓度组，差异具有统计学意义（P<0.05），提示通过抑制TLR4可逐渐恢复UVB造成的细胞损伤，且2 μmo/lL时效果最好，因此确定2 μmo/lL 为本实验的最佳处理浓度。见图3。

图3 MTT 法测定不同浓度TAK-242 处理后HaCaT 细胞的存活率Fig.3 survival rate of HaCaT cells treated with different concentrations of TAK-242 was determined by MTT assay

2.3 各组细胞Caspase-8表达水平比较 为了进一步探讨 TLR2 和 TLR4 在 UVB 对 HaCaT 细胞损伤中的作用机制，是否通过诱导细胞凋亡导致细胞存活率降低，采用Western blot 方法检测了UVB、UVB+TLR2、UVB+TLR4 及 UVB+TLR2-4 组中细胞凋亡分子Caspase-8的表达。结果如图4显示，与UVB 组相比，UVB+TLR2 组Caspase-8 蛋白表达明显上调（P<0.05）；UVB+TLR4 组 Caspase-8 蛋白表达明显下调（P<0.05）；UVB+TLR2-4 组 Caspase-8 蛋白表达显著降低（P<0.01）。说明TLR2 及TLR4 抑制剂联合应用可能通过抑制细胞凋亡，促进细胞存活。

图4 Western blot法检测各组凋亡蛋白Caspase-8表达Fig.4 Western blot was used to detect expression of Cas⁃pase-8

2.4 TLR2 及TLR4 抑制剂对UVB 导致细胞损伤中氧化应激相关分子NF-κB、p-NF-κB 表达的影响 为了探讨氧化应激相关分子NF-κB 的表达参与UVB 引起的HaCaT 细胞损伤过程，采用Western blot方法检测NF-κB、p-NF-κB 蛋白的表达。结果如图5所示，与 UVB 组相比，UVB+TLR2 组、UVB+TLR4 组和 UVB+TLR2-4 组 NF-κB 蛋白表达明显下调（P<0.05），其中UVB+TLR2-4组NF-κB蛋白表达下调显著（P<0.05）；UVB+TLR4组下调明显低于UVB+TLR2组（P<0.05）。与 UVB 组相比，UVB+TLR2 组 p-NF-κB 蛋白表达明显上调（P<0.05），UVB+TLR4 和TLR2-4组明显下调，其中TLR2-4组p-NF-κB蛋白表达下调更加显著。提示TLR2、TLR4 可能通过NF-κB 信号通路参与UVB 导致的细胞损伤，抑制剂TLR2、TLR4能逆转该过程。

图5 Western blot 法检测各组细胞氧化应激相关蛋白NF-κB和p-NF-κB表达Fig.5 Western blot was used to detect expression of in⁃flammatory protein NF-κB and p-NF-κB

2.5 TLR2 及TLR4 抑制剂对UVB 导致细胞损伤中内质网应激相关分子IRE1α、PERK、p-PERK 表达的影响 为了探讨TLR2、TLR4 是否还可通过影响内质网应激参与UVB 介导的细胞损伤，采用Western blot 检测了内质网应激相关蛋白IRE1α、PERK、p-PERK 的表达，结果如图6A 所示，与UVB 组相比，UVB+TLR2组、UVB+TLR4组、UVB+TLR2-4组IRE1α蛋白表达明显下调（P<0.05），其中UVB+TLR2-4 组IRE1α 蛋白表达下调更加显著（P<0.05）。如图6B所示，与 UVB 组相比，UVB+TLR2 组、UVB+TLR4组、UVB+TLR2-4 组 PERK 蛋白表达明显下调（P<0.05），其中 UVB+TLR4 组 PERK 蛋白表达下调更加显著（P<0.05）。如图 6C 所示，与 UVB 组相比，UVB+TLR2 组 、UVB+TLR4 组 、UVB+TLR2-4 组 p-PERK 蛋白表达明显下调（P<0.05），其中UVB+TLR2-4 组p-PERK 蛋白表达下调更加显著（P<0.05），UVB+TLR4 组下调显著低于 UVB+TLR2 组（P<0.05）。结果提示TLR2、TLR4 可能通过内质网应激途径参与UVB 导致的细胞损伤，拮抗TLR2、TLR4能逆转该过程。

图6 Western blot 法检测各组细胞内质网应激相关蛋白IRE1α、PERK、p-PERK表达Fig.6 Western blot was used to detect expressions of en⁃doplasmic reticulum stress-related proteins IRE1α，PERK and p-PERK

3 讨论

由于人类活动影响，氮氧空洞不断扩大，越来越多的UVB 照射到地球上，引起了众多的疾病。皮肤作为全身最大的器官，又是第一道免疫防线，受到的影响较大。天然免疫在皮肤免疫性疾病、皮肤肿瘤，特别是皮肤炎症疾病中发挥非常重要的作用，其中由于UVB 导致的皮肤炎症疾病患者日益剧增引起广泛的关注。目前研究发现UVB 导致的皮肤炎症疾病可能与DNA 损伤，促炎症因子释放，氧化应激与内质网应激的发生，T 淋巴细胞异常活化等有关。

大量研究表明TLRs 不仅可以识别细菌和病毒的病原体相关分子模式，还可以识别衰老死亡或受损的细胞中的损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs），激活细胞内信号分子的级联反应，最终实现识别和清除有害物质，从而在免 疫反 应中发 挥重要 作用［9］。 TLR2 和 TLR4 是TLRs家族的一员，二者均是重要的天然免疫受体之一，当有细菌、病毒和真菌等病原体入侵时，以及体内产生的DAMP均可激活TLRs受体，进而促进促炎转录因子的表达，例如NF-κB和COX2等［10-14］。还有研究表明，DAMP 模式包括氧化的低密度脂蛋白（oxLDL）和氧化的磷脂（oxPL），可上调NF-κB 表达机制引发NLRP3 炎症体，通过髓样分化蛋白-88（MyD-88）依赖途径，进一步介导 NF-κB 磷酸化入核，调控各种细胞炎症因子如IL-1、TNF-α 等释放，诱导细胞凋亡的发生［15-17］。Caspase-8作为细胞凋亡相关蛋白，是细胞凋亡过程中重要的标志分子之一。本实验采用C29和TAK-242 作为TLR2 和TLR4的抑制剂，实验发现随着UVB 照射时间的延长，HaCaT 细胞存活率显著下降，本研究发现与UVB 组相比，UVB+TLR4 组和 UVB+TLR2-4 组的 HaCaT 细胞内细胞凋亡相关蛋白Caspase-8 和细胞炎症相关蛋白 NF-κB 表达水平下降，其中 UVB+TLR2-4 组蛋白表达水平下降更加明显。推测可能是由于UVB照射导致的体内的DAMP 产生增加，通过TLR2 和TLR4信号通路激活下游NF-κB分子，促进炎症细胞因子的产生增加，从而导致细胞凋亡。本研究结果显示 TLR2 抑制剂 C29作用后，UVB 处理的 HaCaT 细胞中Caspase-8 和p-NF-κB 表达较对照组升高，分析其原因可能是由于该抑制剂可能作用于细胞内其他信号分子，参与调控细胞损伤的修复作用，且该抑制剂也可能通过影响其他凋亡途径分子或其他凋亡途径发挥的抑制凋亡作用，但还需进一步研究证实。

有研究表明，UVB 可诱导产生活性氧ROS 等成分，并对不同细胞成分如细胞核、脂质膜、内质网以及线粒体等产生氧化损伤［18-19］。氧化应激反应可能是皮肤细胞受到UVB 损伤后发生的主要反应，HaCaT 细胞与人类角质层细胞十分相似，可以无限传代，并且Toll 样受体在其内均有表达。TLR-2 和TLR-4 是氧化应激中的一个重要受体，参与许多信号通路传导，因此猜测阻断这两个受体相关的传导通路可能会终止部分氧化应激反应，从而减轻细胞损伤。MISTRY 等［20］研究结果证实，TLR2 和 TLR4抑制剂干预可以明显减缓氧化应激所致的THP-1巨噬细胞，HEK293T 等细胞凋亡的发生和细胞炎症因子的释放。本实验结果显示TLR2 和TLR4 抑制剂可降低UVB 导致的细胞损伤，TLR4 抑制剂使用效果明显优于TLR2 抑制剂，且两者使用效果更好。这可能是通过抑制TLR-4/MyD-88/NF-κB 丝裂原激活的蛋白激酶和半胱天冬酶途径的激活，并下调氧化剂的释放，从而降低了炎症反应，氧化应激以及凋亡的发生［21］。但还需要进一步研究证实。

UVB 可以导致内质网中未折叠的蛋白积聚和Ca2+失衡。SHIMASAKI 等［22］研究结果表明，通过内质网应激诱导物如毒胡萝卜素，衣霉素或二硫苏糖醇会增加上皮细胞TLR2 的表达，还增强了TLR2 配体的反应性，说明内质网应激在调节TLR2 依赖性炎症反应中起重要作用。本实验结果表明，West⁃ern blot 检测HaCaT 细胞被UVB 照射后内质网应激蛋白表达水平变化显示，与UVB 组对比，UVB+TLR2 组和 UVB+TLR4 组的 IRE1、PERK 和 P-PERK蛋白表达明显下降（P<0.05），TLR2-4组蛋白表达下降更加显著（P<0.05）。通过加入 TLR2 和 TLR4 抑制剂可以明显降低内质网应激蛋白的表达，说明通过阻断TLR2 和TLR4 受体通路可以缓解UVB 造成的HaCaT 细胞内质网应激损伤，并且两种抑制剂一起使用抑制效果更好。

综上所述，本研究初步证明UVB 可以导致Ha⁃CaT 细胞发生内质网应激并使细胞发生凋亡，通过阻断TLR2 和TLR4 信号途径可缓解UVB 造成的氧化应激和内质网应激损伤，从而可能抑制了UVB 对细胞损伤作用，本研究为以TLR2 及TLR4 为靶点治疗UVB 所致皮肤炎症疾病提供新的思路和实验依据。