郭 斌， 马逸杰， 杨 舟△， 岳增辉△

(1.湖南中医药大学针灸推拿学院，长沙 410021；2.宁夏医科大学中医学院，银川 750004)

脑卒中肢体痉挛状态是一种以肢体偏瘫为表现的运动功能性障碍状态,脑卒中发生后神经元大量死亡，从而引起突触结构的破坏最终发生一定的神经功能损伤[1]，使患者的生活质量受到较大影响[2]。脑卒中发生时大脑内神经营养因子广泛参与脑卒中的发生过程，其主要参与受损突触结构与功能的恢复，是神经损伤、神经细胞凋亡以及神经功能恢复的重要影响因素[3]。

对脑卒中肢体痉挛状态的治疗中医各家有不同的方法[4]。《百症赋》中记载：“半身不遂，阳陵远达于曲池。”曲池平肝潜阳而祛内风，阳陵泉舒筋活络抑肝风，二者配伍调达气机，强筋健骨[5]。本课题组前期研究发现，电针“曲池”“阳陵泉”可以调节各组神经递质，从而缓解脑卒中肢体痉挛及肌张力紧张的症状[6，7]。《伤寒论》芍药甘草汤以“酸甘化阴”论治，使筋脉得阴津濡润,从而解除痉挛，改善肌张力[8]。本团队通过临床观察得出针灸与中药配合使用，能更好地缓解脑卒中后偏瘫患者肌张力,改善运动功能,提高日常生活活动能力[9]。本研究拟通过实验观察电针、中药以及针药结合3种治疗方法，对CSA大鼠海马区BDNF、TrkB的干预效应，分析遴选最适宜该疾病的治疗方法。本研究已通过湖南中医药大学实验动物伦理委员会批准，实验动物批号20171103。

1 材料

1.1 动物

SPF级健康成年SD雄性大鼠77只，7周龄，体质量(240±30)g，由湖南斯莱克景达动物实验有限公司提供，实验动物使用许可证号SCXK(湘)2016-0002。饲养湖南中医药大学动物实验中心，普通饲料投喂，室温(25±2)℃，相对湿度65%～70%，自然光照，自由进食饮水。

1.2 药物

加味芍药甘草汤组成：白芍30 g，甘草10 g，黄芪30 g，桑枝30 g，伸筋草10 g，山萸肉10 g，枸杞10 g，当归15 g，川芎15 g，地龙10 g，鸡血藤15 g，木瓜10 g，水煎剂，湖南中医药大学第二附属医院中药房，均由王竹鑫主任鉴定，先按比例配方取药，然后将饮片以蒸馏水浸泡1 h ,继以武火急煎至沸腾, 再以文火煎煮2 h , 取汁后以四层纱布过滤；药渣再加蒸馏水文火煎煮 1 h ,过滤取汁，2次药汁合并,将药物浓缩至含生药10 mL·kg-1。

1.3 主要试剂与仪器

N-甲基-D-天冬氨酸受体(美国Sigma公司，货号M3262)；PVDF转GAT-1(美国millipore公司，货号IPVH00010)；化学发光试剂(美国millipore公司，货号WBKLS0010)；β-Actin(Bioswamp武汉贝茵莱生物科技有限公司，货号PAB36265)；BDNF(英国abcam公司，ab108319)；TrkB(英国abcam公司，ab18987)；GoatAnti-RabbitIgG(Bioswamp武汉贝茵莱生物科技有限公司，货号PAB160011)；SYBRGreenPCR试剂盒(Bioswamp武汉贝茵莱生物科技有限公司，货号KM4101)；PBS 磷酸盐缓冲液(Bioswamp武汉贝茵莱生物科技有限公司，货号PAB180003)。

H7650型透射电镜(日本日立高新科技公司);SN-2型大鼠脑立体定位仪(日本成茂公司);SDZ-V型电子电针仪(苏州医疗用品厂有限公司);5ul型微量注射器(上海科晓科学仪器有限公司);CFX-Connect96型荧光定量 PCR 仪(美国Bio-Rad公司);针灸针(苏州医疗用品厂有限公司,0.30×13 mm);miniprotean3cell型电泳仪(美国Bio-Rad公司);MD1000型正置显微镜(徕卡显微系统有限公司);Tanon-5200型全自动化学发光分析仪(上海天能科技有限公司);Centrifuge5424R型离心机(德国Eppendorf公司);Nano-300型超微量分光光度计(杭州奥盛仪器有限公司)。

2 方法

2.1 分组、造模及制备

将大鼠通过2次随机数字表法分为正常组、模型组、假手术组、电针组、中药组、和针药组6组各9只。采用改良Zea-longa线栓法+内囊注射NMDA受体法制作脑卒中肢体痉挛大鼠模型[10]。麻醉成功后仰卧位备皮、消毒，颈部正中偏右做切口，钝性分离右侧颈总动脉迷走神经，向上暴露颈总动脉分叉处、颈内动脉与颈外动脉；各自结扎颈外动脉近心端、颈总动脉远心端，动脉夹夹闭颈内动脉；颈总动脉分叉膨大5 mm处做一小切口，栓线经切口插入颈内动脉，松开动脉夹深度约18～20 mm感到阻力停止插线；完毕后，将颈内动脉近心端和栓线一起结扎逐层缝合；大鼠清醒后纳入Zea-Longa评分1～3分的大鼠第2天再行内囊注射NMDA受体法[11]。经查阅文献发现，NMDA与脑卒中肢体痉挛关系极为密切，大脑注射NMDA受体的实验可行性强[12]；反复摸索浓度后确定为将5 mg NMDA受体溶于5 mL灭菌生理盐水中，制成浓度为1 mg·mL-1的溶液，37 ℃孵箱中孵育7 d，凝聚状态备用[13，14]。继续麻醉俯卧固定大鼠脑立体定位仪上备皮、消毒，逐层分离暴露前囟、额骨和右侧顶骨交界骨缝；《大鼠立体定位图谱》确定内囊位置(前囟后1.4 mm，矢状缝右侧2.4 mm)[15]，在颅板上钻一直径约2 mm小孔，将微量注射器垂直插入7 mm，以1 μL/min速度注射NMDA受体，完毕后明胶海棉小心压迫止血、消毒并缝合。

2次术后伤口均给予青霉素抗感染；按0.1 mg·kg-1剂量腹腔注射速尿，防止颅内水肿；葡萄糖水及饲料喂养，单笼饲养并保持呼吸道通畅。

2.2 各组大鼠处理方法

2.2.1 电针组 以解剖学知识为基础，根据郭义[16]主编的《实验针灸学》“动物针灸穴位图谱”进行穴位定位。曲池：桡骨近端关节外侧前方的凹陷中，直刺3 mm。阳陵泉：距足三里(大鼠膝关节下侧腓骨小头下约3 mm)上外侧5 mm，直刺3 mm。大鼠仰卧位束缚常规消毒，常规针刺捻转角度90～180°，频率60～90次/min，持续1 min，选用SDZ-V电针治疗仪密波，100 Hz，电流强度1～3 mA。因为卒中后两侧肢体的肌张力及神经损伤情况不同，且取穴原理为上下同施[17]，故未采用主调节全身功能性疾病的穴位局部刺激[18]及水平两侧穴位连接电极[19]，而是正极接在肢体一侧的阳陵泉穴毫针针柄，负极接同侧曲池针柄形成剌激回路[20]，以大鼠肢体轻微抖动为度，每日1次，每次30 min，连续5 d。

2.2.2 中药组 先按比例配方取药，然后将饮片以蒸馏水浸泡1 h ,将药物浓缩至含生药10 g·ml-1。将制备好的加味芍药甘草汤水煎剂温热，剂量按照成人量换算成动物剂量，灌胃容积为10 mL·kg-1体质量，每日1次，连续5 d。

2.2.3 针药组 先行中药灌胃，每天1次；30 min后再行电针治疗，每次30 min，每日1次，连续5 d。

2.2.4 其他组 造模时，假手术组只做分离，不结扎不插线。各组术后青霉素80万U/d肌肉注射，共4 d。治疗时，除空白组外均同电针组一样束缚30 min，均同药物组等量生理盐水灌胃，每日1次，连续5 d。

2.3 动物行为学检测

表1示，5 d治疗后依据Zea-longa[21]神经功能评分表进行评分，将大鼠置于干净的空鼠笼中任由其自由运动，每只观察1 min并进行相应的视频记录。

表1 Zea-longa神经功能评分比较

2.4 取材方法

行为学评分后各组大鼠禁食不禁水18 h，水合氯醛(10%，3 mL·kg-1)腹腔注射进行麻醉后，麻醉断头冰盘上取患侧海马区，取一部分切成体积为1 mm3左右大小的米粒状，置于2% 戊二醛混合固定液固定供电镜检测；其余部分置于冻存管内放液氮中迅速降温1 d，随后放入-80 ℃冰箱储存供PCR和WB检测。

2.5 电镜观察各组大鼠海马区突触超微结构变化

脱水、渗透、包埋后制成70 nm的超薄切，行醋酸铀-柠檬酸铅双染色，H7650透射电镜观察并采集照片。

2.6 RT-PCR检测大脑海马区BDNF、TrkBmRNA的表达

采用Trizol 提取组织样本中总RNA，使用PCR仪将1ug总RNA反转录为cDNA。表2示，各样品目的基因和内参基因引物序列。PCR反应条件: 95 ℃2 min，95 ℃45 s，53 ℃45 s，72 ℃ 30 s，40 循环,数据采用仪器自带qbase plus软件分析荧光CT值，按照 2-△△ct相对定量计算公式，计算出各样品的目的mRNA相对定量结果。

表2 引物设计

2.7 WB检测大脑海马区BDNF、TrkB蛋白的表达

提取25 μg 蛋白进行 10% SDS-PAGE，并将蛋白转移至硝酸纤维素膜(PVDF) 上，5%脱脂牛奶封闭 1 h，分别加入稀释的一抗(BDNF 1∶2000；Trkb 1∶2000；β-actin 1∶2000)后 4 ℃ 孵育过夜，洗涤后滴加稀释的二抗(1 ∶ 10000) 室温孵育30 min，洗涤后 ECL 化学发光液孵育1 min，使用全自动数码凝胶图像分析系统拍照，利用Tanon-4100 GIS3.0软件获取相关条带灰度值。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 行为学检测结果

行为学测试结果表明，与空白组比较，模型组神经功能评分增高(P<0.01)，提示模型构建成功；与模型组比较，各治疗组评分均有明显下降(P<0.05)。

表3 6组大鼠神经损伤情况比较{M(Q)}

3.2 电镜观察各组大鼠海马区突触超微结构变化

图1示，电镜下观察与空白组比较，模型组突触数量减少明显，囊泡数量减少，突触后细胞终末胞质变性溶解显著，突触后致密带密度下降，前后膜发生融合，间隙界限模糊;与模型组比较，各治疗组的突触数量明显增多且相对密集，囊泡数量增多，新生的凹形突触增加，突触后致密物增厚，间隙规则紧致，说明各治疗组均可对神经突触结构产生一定的修复重塑作用。而3组治疗组中，针药组突触结构改善最佳。

注：A.突触小体；B.突触前膜；C.突触后膜；D.突触间隙.E.突触小泡

3.3 各组大鼠大脑海马区BDNF、TrkBmRNA表达比较

表4示，模型组与空白组比较，BDNF、TrkB mRNA的表达均降低(P<0.01)；而电针组、中药组及针药组与模型组比较，BDNF、TrkB mRNA的表达均升高(P<0.05)，针药组升高最明显(P<0.01)。

表4 各组大鼠大脑海马区内BDNF、TrkBmRNA表达比较

3.4 各组大鼠大脑海马区内BDNF、TrkB蛋白表达影响

图2表5示，模型组与空白组比较，BDNF、TrkB蛋白表达均降低(P<0.01)；而模型组与电针组、中药组及针药组比较，BDNF、TrkB蛋白的表达均有升高(P<0.05)，针药组升高最明显(P<0.01)。

表5 各组大鼠大脑海马区内BDNF、TrkB蛋白表达的影响

图2 各组大鼠大脑海马区内BDNF、TrkB蛋白表达条带

4 讨论

BDNF是中枢神经系统内广泛分布的一种促进神经生长活性的碱性蛋白质，主要作用于神经元的存活、分化、生长和发育，对中枢神经系统发育具有重要意义。TrkB是BDNF信号传导通路上高度亲和的配体，TrkB是激活下游信号传导通路的必要因子，发生某些应激情况时，二者根据应激类型、时间及大脑部位的不同而发生不同改变，这种改变可引起神经元的凋亡以及参与多种中枢神经系统疾病，而二者结合强度的增高又可以发挥神经元的修复及再生作用[22]。

BDNF参与突触的可塑性。神经元的生理活动过程中，BDNF广泛转录合成并运输储存至树突中，增加了树突的分支，扩大了树突面积并使树突间产生各种联系，最终增加树突形态的多效性，影响突触的可塑性。BDNF与TrkB结合促进神经元胞体和树突中BDNF合成后运送至突触前膜，并影响突触后膜上相关神经递质的数量及分布[23]。脑卒中恢复过程中，BDNF能够维持损伤后的神经元树突结构形态的正常[24]，而对于新生且未成熟的神经系统，BDNF可以通过突触前后的作用机制调节突触数量、突触功能以及树突形态，从而调节突触可塑性[25](见图3)。

图3 BDNF参与脑可塑性比较

课题组在前期研究中论证了SCA的神经功能损伤与γ-氨基丁酸(GABA)在大脑中的表达有关[26]，作为大脑中枢神经系统中的抑制性神经递质，其减少可以引起肌张力增强，发生脑卒中肢体痉挛状态[27]。而各类神经递质数量及分布在突触后膜受BDNF影响，当BDNF表达异常时，突触递质发生变化，从而引起各类神经元功能的紊乱[28]。脑卒中肢体痉挛状态下BDNF数量减少，随之与TrkB的结合减少，使得突触可塑性受到一定影响，最终导致GABA的释放减少，突触抑制性降低，神经的兴奋性增强而引起肢体痉挛，所以BDNF的表达与SCA密切相关。

本实验通行为学观察、电镜观察、Western Blot、RT-PCR方法，对脑卒中肢体痉挛大鼠海马区突触结构以及BDNF、TrkB的mRNA与蛋白表达进行观察。结果显示，各种治疗均可改善脑卒中肢体痉挛的神经突触受损情况，而大脑海马区是神经损伤最严重的区域之一，海马区中神经突触的重塑是恢复神经功能的关键因素，针药结合的方法可以更好地促进海马区神经营养因子的产生，使得损伤的神经元恢复再生，进而改善中枢神经系统受损的运动功能，缓解脑卒中痉挛状态。

针药结合是在中医学和/或现代医学理论指导下，根据针灸、药物作用特点和各自特长，针对同一病证形成实施针灸与药物同时进行治疗疾病的临床方案的科学过程[29]。此过程不是二者作用的简单叠加,而是相互补充、相互协同的关系。既往研究报道，中医复方[30]、单味中药[31]以及针灸[32-33]均能改善SCA损伤的神经功能。本实验结果证实，针药结合疗效优于单纯针灸或单纯中药治疗，治疗机制与其调节神经营养因子与突触可塑性有关。本实验还存在一些不足，如针药结合的时间、量效问题及临床运用规律等，课题组下一步将围绕这些问题进行研究。