张震 王梅芳 宋远见

1徐州医科大学遗传学学科（江苏徐州221004）；2徐州市医学遗传与工程研究中心（江苏徐州221004）；3常熟市第二人民医院麻醉科（江苏常熟215500）

缺血性脑卒中是一种常见的脑血管病，是造成患者死亡和残疾的主要原因［1］。缺血性脑卒中发作后，在梗死核心区会造成相应的神经元及脑血管损伤，进而导致脑内环境紊乱，影响相应脑区的功能［2］。卒中后常伴随着焦虑行为［3］，该行为与杏仁核的损伤关系密切。如今，焦虑已经成为卒中后最主要的神经精神病之一，影响着卒中后神经功能康复［4］。而JNK 和p38 MAPK 信号通路在焦虑样行为调控以及脑缺血后细胞损伤进程中发挥着重要的作用［5-6］。瞬时受体电位香草酸1（TRPV1），在神经元及脑内皮细胞中广泛表达。已有研究报道，TRPV1 在脑缺血后激活并造成神经和运动功能缺陷［7］。抑制TRPV1 还能减轻外伤性脑损伤后的血脑屏障破坏［8］。这表明TRPV1 在缺血性脑损伤以及血脑屏障损伤中起到重要的调节作用。脑缺血后TRPV1 是否会通过调控JNK 和p38 MAPK 信号通路影响脑血管通透性并改变焦虑样行为尚未明确。探明该问题，对于寻找新的药物靶点和治疗脑缺血后的焦虑情绪，减轻血脑屏障损伤具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 实验试剂Capsazepine（Sigma 公司）、HE 试剂盒（中国碧云天公司）、CD31 抗体（Abcam 公司）、Claudin5 抗体（Invitrogen 公司）、DAPI 染色液（中国碧云天公司）、p-JNK（Santa Cruz 公司）、p-p38 MAPK（CST 公司）、BCA 试剂盒（中国碧云天公司）。

1.2 实验动物7 ～8 周龄SPF 级C57BL6/J 雄性小鼠54只，体质量22 ～24 g，分为假手术组（Sham）、缺血再灌注组（I/R）、缺血再灌注+抑制剂组（I/R+CPZ）。小鼠由山东济南朋悦实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（鲁）2019 0003。实验过程中针对所有小鼠实验操作均遵循实验动物福利伦理审查指导原则，实验后小鼠均深度麻醉后脱臼处死。

1.3 小鼠大脑中动脉栓塞模型制作采用线栓法构建MCAO 模型，缺血1 h，再灌注24 h。术前将小鼠禁食12 h，麻醉小鼠后，沿颈部正中线切开皮肤，分离右侧的颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉。将线栓从颈外动脉插入颈内动脉，进而进入大脑中动脉。当插线栓的过程中遇到轻微阻力时，立即停止插线栓，待缺血1 h 后，将线栓缓慢退出。

1.4 侧脑室注射在术前30 min 侧脑室注射TRPV1抑制剂CPZ（7.50 μg/3 μL每只）。以Bregrma点为原点，定位右侧脑室位置（位于Bregrma 点向后0.50 mm，旁开1.00 mm，深2.20 mm），并用记号笔标记，然后用颅骨钻钻孔。用微量注射器吸取3 μL CPZ，注射时间持续7 min，然后留针10 min后缓慢退针。缝合并消毒皮肤，将小鼠放入保温箱中饲养。

1.5 高架十字迷宫实验实验用小鼠共36 只。实验前让小鼠适应15 min，使用75%酒精清理迷宫内部。实验开始时将小鼠提起放置于中央区域，保持其头朝开放臂。小鼠进入开放臂或封闭臂的条件以四只爪子进入该臂区域为准。实验过程中应保持安静。每次实验后同样用酒精擦拭迷宫。实验过程中使用Anymaze 行为学分析软件对小鼠活动进行记录。

1.6 HE 染色实验用小鼠共9 只。小鼠缺血再灌注24 h 后心脏灌流，然后断头取脑，使用冰冻切片机切片，厚度20 μm。样本用苏木精染色，然后1%盐酸酒精分化，返蓝，伊红染色，常规脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，于400×视野下观察。

1.7 免疫荧光染色实验所用样本与HE 染色为同一批样本。实验前将脑片室温放置30 min 复温。将山羊血清滴加到脑片上，封闭2 h。弃去血清，将Claudin5 一抗按比例（1∶300）稀释，覆盖脑片，4 ℃冰箱过夜。PBS 洗涤5 min，3 次。将二抗按比例（1∶500）稀释，覆盖脑片，室温孵育2 h。弃去二抗，PBS 洗涤5 min，3 次。DAPI 染色液染核10 min，弃去染色液，PBS 洗涤5 min，3 次。封片后在荧光显微镜下进行观察。

1.8 蛋白免疫印迹实验用小鼠共9 只。小鼠缺血再灌注24 h 后处死，取小鼠脑组织提取总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，采用湿转法将蛋白转移到NC 膜上，置于5%脱脂牛奶室温封闭2 h后加入需要检测蛋白的一抗、二抗，TBST 洗净，于奥德赛蛋白显影仪下显影，进行半定量计算。

1.9 统计学方法SPSS 21.0分析实验数据，计量资料之间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抑制TRPV1 能够减轻小鼠脑缺血后焦虑样行为为了检测小鼠脑缺血后的焦虑样行为，在小鼠脑缺血再灌注7 d 后进行高架十字迷宫检测（图1）。结果显示，与I/R组比较，I/R+CPZ组小鼠在开臂的移动距离和停留时间显著增加（P＜0.001），表明抑制TRPV1 可减轻小鼠脑缺血再灌注后焦虑样行为。

图1 CPZ 减轻造模后小鼠焦虑样行为Fig.1 CPZ reduces anxiety-like behavior in mice after MCAO

2.2 抑制TRPV1 能够减轻小鼠脑缺血后病理损伤、组织水肿在小鼠再灌注24 h 后，通过HE 染色观察小鼠杏仁核脑区病理损伤状况（图2）。HE染色结果显示：相较于I/R 组，I/R+CPZ 组胞质着色变深，细胞核固缩减少，表明抑制TRPV1 减轻小鼠脑部病理损伤。

图2 Capsazepine 减轻小鼠脑病理损伤、组织水肿（×400）Fig.2 CPZ reduces brain pathological damage and tissue edema in mice（×400）

2.3 抑制TRPV1 能够减轻小鼠脑缺血后杏仁核区脑血管损伤为了检测小鼠脑血管损伤情况，在小鼠再灌注24 h后进行了免疫荧光染色（图3）。结果显示，与I/R 组比较，I/R+CPZ 组Claudin5 表达量增加，表明抑制TRPV1 可减轻小鼠脑血管损伤。

图3 抑制TRPV1 能够减轻小鼠脑缺血后杏仁核区脑血管损伤Fig.3 Inhibition of TRPV1 can alleviate cerebral vascular injury in amygdala after cerebral ischemia in mice

2.4 抑制TRPV1降低脑缺血后p-JNK、p38 MAPK水平为了探讨TRPV1对JNK和p38 MAPK信号通路的影响，通过免疫印记检测了小鼠再灌注24 h后p-JNK、p-p38MAPK的蛋白水平。对条带进行分析后得出了蛋白的相对表达量（图4）。结果表明，与I/R组比较，I/R+CPZ 组小鼠p-JNK、p-p38 MAPK 水平降低（P＜0.05），表明抑制TRPV1 降低了脑缺血后p-JNK、p-p38MAPK蛋白水平。

图4 CPZ 减少p-JNK、p-p38 MAPK 蛋白水平Fig.4 CPZ reduces p-JNK，p-p38 MAPK protein levels

3 讨论

全世界每年有将近1 700 万人患脑卒中，其中30%～35%患者死亡，剩下的患者也存在运动以及精神障碍等后遗症［9］。焦虑和抑郁已经成为卒中后两大主要的精神病，临床数据表明25%的卒中患者都伴随着焦虑症状［10-11］。TRPV1 在缺血性脑卒中后起到病理性作用［7］，但TRPV1 对脑缺血后血脑屏障和焦虑样行为的作用还未见报道，因此本研究选择TRPV1 作为研究靶点，以期能够探明TRPV1 在缺血性脑卒中后对血脑屏障和焦虑样行为的作用。

本研究中，高架十字迷宫结果表明I/R+CPZ 组小鼠较I/R组小鼠在开臂的移动距离和停留时间显著增加，表明抑制TRPV1能够减少小鼠脑缺血后焦虑样行为。在MARSCH等［12］的研究中，TRPV1 敲除鼠表现出更少的焦虑样行为。SRIVASTAVA［13］研究表明抑制P2X4 受体减轻脑缺血诱导的焦虑样行为，本研究结果与其一致。目前认为脑杏仁核区与焦虑样行为的调节密切相关，CHEN 等［14］研究表明，杏仁核给药能减轻外周神经损伤后焦虑样行为的发展。本研究通过HE 染色实验发现，I/R组小鼠杏仁核脑区细胞受损现象严重，大量细胞核呈核固缩形态。在抑制TRPV1 后，细胞损伤减少，细胞核形态改善。

脑卒中后常见的一个病理特征是血脑屏障的破坏［15］，而脑血管内皮细胞间紧密连接蛋白的破坏是脑卒中后血管通透性升高的主要原因［16］。在正常大鼠中，使用激动剂激活TRPV1 本身就会导致血脑屏障的破坏［17］。YANG 等［8］的研究也表明抑制TRPV1 能减轻外伤性脑损伤后的血脑屏障破坏，而本实验表明，在缺血性脑卒中后，抑制TRPV1 能够减轻紧密连接蛋白Claudin5 的表达，表明在脑缺血后，TRPV1 也是血脑屏障破坏的原因之一。

JNK 和p38 MAPK 通路在脑缺血诱导的细胞损伤中具有重要的作用，有研究表明钙离子敏感受体在小鼠脑缺血后通过激活JNK 和p38 MAPK信号通路促进细胞凋亡［18］。在LIU 等［19］的研究中也表明，抑制TRPV1 能减少JNK 的激活。TRPV1作为亲钙离子型离子通道蛋白，因此笔者推测TRPV1 可能通过JNK 和p38 MAPK 信号通路调控脑缺血损伤。本研究中免疫印迹结果也已经证明抑制TRPV1 能降低p-JNK、p-p38 MAPK 的蛋白水平，表明TRPV1 可能通过JNK 和p38 MAPK 通路调节脑缺血后的焦虑样行为以及血脑屏障损伤。

TRPV1 在缺血性脑卒中的病理作用已有报道，然而具体的损伤机制以及在缺血性脑卒中后TRPV1 对焦虑样行为和血脑屏障的作用还未见报道。本研究证明了抑制TRPV1 可以降低小鼠脑缺血后p-JNK、p-p38 MAPK 的蛋白水平，减少脑缺血诱导的紧密连接蛋白Claudin5 的破坏，改善小鼠脑缺血诱导的焦虑样行为。目前对于缺血再灌注损伤的治疗方法还比较少，预缺血处理治疗心脏缺血的方法之一，但对脑缺血来说还比较危险［20］。本研究结果表明抑制TRPV1 可通过干扰JNK 和p38 MAPK 信号通路减少脑缺血后焦虑样行为及血管损伤，为缺血性脑损伤的治疗提供了新的靶点和实验依据。然而TRPV1 属于离子通道蛋白，最能反映其活性的应该是电生理实验检测通道周围膜电势，本研究还未进行相关实验。而且本研究涉及的损伤机制尚比较浅薄，需要进一步研究。