赵雨，褚海清，王结鑫，王倩，张立明,2,3*

(1.宁夏医科大学药学院，宁夏 银川 750004；2.宁夏特色中医药现代化工程技术研究中心，宁夏 银川 750004；3.宁夏医科大学回医药现代化教育部重点实验室，宁夏 银川 750004)

0 引言

二精方颗粒剂是由枸杞、黄精两味中药材配伍通过现代制剂技术制成的一种制剂，在古方《圣济总录》中记载二精方以丸剂为剂型，以蜜调和，主“筑气益精、补填丹田，活血驻颜，长生不老”[1]。本研究前期实验表明，对Ⅱ型糖尿病小鼠进行二精方多糖及黄酮类提取物干预，其具有降糖降脂、缓解糖尿病所引起的“三多一少”等症状[2-4]，因此，将其开发成具有降糖功效的颗粒剂，且颗粒剂疗效迅速，能满足患者携带使用方便、易于贮存的愿望。

目前，关于二精方颗粒的质控标准还未见报道。方中两味药材枸杞和黄精均为益阴药，且所含多糖类成分和黄酮类成分较多，枸杞的现代研究表明其枸杞多糖具有抵抗衰老、保护神经和心血管、抗氧化和预防糖尿病的作用[5-6]，黄精中的主要活性成分多糖和黄酮类也具有抗氧化、降低血糖血脂、调节免疫力等作用[7]。基于上述研究及前期的实验证明枸杞、黄精中的多糖及黄酮类成分对糖尿病具有一定的预防和治疗作用。鉴于此，本研究旨在建立二精方颗粒剂中枸杞和黄精的TLC鉴别法，多糖类及黄酮类成分的高效液相色谱法(HPLC)，以期为该制剂的质量标准提供依据。

1 材料

1.1 仪器

KQ-250E型超声波器(昆山市超器有限公司)；恒温水浴锅(北京长源实验设备厂)；循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；电子计重秤(厦门佰伦斯电子科技有限公司)；粉碎机(屹立工贸有限公司)；RE-2000A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；分析天平(梅特勒-托利多)；高效液相色谱仪(Agilent 1260)。

1.2 试药

枸杞(批号：070101，产地：宁夏，石家庄市柏林药材加工厂)；黄精(批号：070101，产地：四川，石家庄市柏林药材加工厂)标准品：D-葡萄糖(中国食品药品检定研究院，批号：110833-201506)；D-甘露糖(中国食品药品检定研究院，批号：140651-201504)；芦丁(中国食品药品检定研究院，批号：100080-200707)。

2 方法与结果[8-9]

2.1 枸杞的薄层鉴别

2.1.1 供试品溶液的制备

取本品1.0 g，研细，加水70 mL，加热煮沸15min，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯30mL振摇提取，分取乙酸乙酯液，浓缩至l mL，即得。

2.1.2 对照药材溶液的制备

取枸杞子对照药材0.5 g，加水35 mL，加热煮沸15min，放冷，滤过，滤液用乙酸乙酯15mL振摇提取，分取乙酸乙酯液，浓缩至l mL，即得。

2.1.3 阴性对照液的制备

按处方除枸杞外的药材制备颗粒，据2.1.1项下处理，即得。

2.1.4 TLC鉴别

照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述三种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸(3：2：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。结果，在枸杞对照药材色谱相应的位置上，供试品品显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照物干扰，见图1。

图1 枸杞的薄层色谱鉴别

2.2 黄精的薄层鉴别

2.2.1 供试品溶液的制备

取本品l.0 g，研细，加70%乙醇 20 mL，加热回流1h，抽滤，滤液蒸干，残渣加水10 mL 使溶解，加正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇l mL使溶解，即得。

2.2.2 对照药材溶液的制备

取黄精对照药材l.0 g，加70%乙醇 20 mL，加热回流1h，抽滤，滤液蒸干，残渣加水10mL 使溶解，加正丁醇振摇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇l mL使溶解，即得。

2.2.3 阴性对照液的制备

按处方除黄精外的药材制备颗粒，据2.1.1项下处理，即得。

2.2.4 TLC鉴别

照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验，吸取上述三种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60~90℃)-乙酸乙酯-甲酸(5：2：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。结果，在黄精对照药材色谱相应的位置上，供试品品显相同颜色的荧光斑点，且阴性对照物干扰，见图2。

图2 黄精薄层色谱图

2.3 二精方中多糖类成分的含量测定

2.3.1 色谱条件

安捷伦 XDB-C18(4.6×250 mm，5 μm)色谱柱，磷酸盐缓冲液 (pH 6.8)(A)：乙腈 (B)=84：16 等度洗脱；流速为 1 mL·min-1，检测波长：250 nm，柱温为 30℃，进样量为 10 μL。

2.3.2 对照品溶液的制备

精密称取葡萄糖、甘露糖分别置于试管中，分别加入0.3 mol·L-1的NaOH溶液5 mL振荡溶解，取溶解后的溶液100 μL，加入0.5 mol·L-1的PMP甲醇溶液50 μL，70℃水浴中反应30 min后冷却至室温，加0.3mol·L-1的盐酸100 μL中和，混匀，用等体积三氯甲烷萃取3次，取水层，针筒式微孔滤膜过滤，滤液作为多糖类成分对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备

取本品，研细，取约5 g，加水溶解，加入氯仿-正丁醇(4：1)混合溶液脱蛋白，剧烈振荡后离心，得上清液，加入95%的乙醇，静置过夜后过滤，所得沉淀依次用 95%乙醇、无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，烘干得精制多糖。取精制多糖50 mg，精密称定，置螺帽试管中，加三氟乙酸2 mL，使溶解，密封，于100 ℃ 烘箱中水解8 h，吹干，残渣加甲醇1 mL，使溶解，吹干，加水使溶解，即得多糖水解液。在水解液中加 1.2 mL的1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)甲醇溶液，1 mL的氢氧化钠溶液，混匀，置水浴加热，取出，冷却至室温，加盐酸溶液调节至中性，混匀，用等体积三氯甲烷萃取3次，取水层，针筒式微孔滤膜过滤，即得。

将制备的供试品与标准品分别注入液相色谱仪进行检测，记录HPLC谱图。色谱图见图3。

考虑到基于UDP/IP栈的《RSSP-I安全协议》源自于阿尔斯通公司的《FSFB/2安全协议》，已广泛应用于大铁路信号系统轨旁设备之间的安全通信，因此互联互通CBTC系统车地安全通信解决方案直接采用《RSSP-I安全协议》来执行安全通信，并分别部署在与功能安全相关的车载和地面信号设备中。

图3 二精方颗粒多糖类成分HPLC色谱图

2.3.4 方法学考察

2.3.4.1 线性关系考察

精密吸取“2.3.2”项下标准品溶液，按照“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录甘露糖、葡萄糖峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，标准品溶液浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，得葡萄糖回归方程为y=5114.2x-212.52(r=0.9998，n=6)；得甘露糖回归方程为y=5839.1x - 369.59(r=0.9996，n=6)。表明葡萄糖和甘露糖分别在0.17~4.18 mg/mL、0.19 ~4.75 mg/mL范围内呈良好线性关系。

2.3.4.2 精密度考察

精密吸取“2.3.3”项下供试品溶液，连续进样6次，记录面积，结果，甘露糖、葡萄糖RSD值为0.74%、0.31%。

2.3.4.3 稳定性考察

精密吸取“2.3.3”项下供试品溶液，于 0、3、6、9、12、24 h分别进样，记录峰面积，结果，甘露糖、葡萄糖RSD为0.35%、0.26%。

2.3.4.4 重复性考察

取同一批次颗粒，按“2.3.3”项下方法平行制备6份样品，进样，记录峰面积，结果，甘露糖、葡萄糖RSD为0.39%、0.22%。

精密称取已知含量样品6份，分别加入“2.3.2”项下标准品溶液，按“2.3.3”项下处理，进样，记录峰面积并计算加样回收率。结果，甘露糖和葡萄糖RSD分别为0.14%、0.29%(n=6)，表明加样回收率良好。

2.4 二精方中黄酮类成分的含量测定

2.4.1 色谱条件

安捷伦 XDB-C18(4.6×250 mm，5 μm)色谱柱，流动相为乙腈：水：冰乙酸 =5：94.5：0.5(A)和乙腈：水：冰乙酸 =70：29.5：0.5(B)；梯 度 洗 脱 条 件：0-14 min：100%-86%(A)；14-22 min：86%-84%(A)；22-40 min：84%-70%(A)；40-60 min：70%-100%(A)；流速为 1 mL/min，检测波长：254 nm，柱温为30℃，进样量为 10 μL。

2.4.2 对照品溶液的制备

精密称取芦丁，置于10 mL容量瓶中，加乙醇溶解并定容至10 mL。过0.22 μm滤膜，取续滤液即得。

2.4.3 供试品溶液的制备

取本品，研细，取约5 g，精密称定，加入乙醇，超声提取两次，滤过，合并滤液，减压浓缩，浓缩液经HPD-600型大孔树脂，蒸馏水除去水溶性杂质后，50%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，微孔滤膜过滤，即得。

将制备的供试品与标准品分别注入液相色谱仪进行检测，记录HPLC谱图。色谱图见图4。

图4 二精方颗粒黄酮类成分HPLC色谱图

2.4.4 方法学考察

2.4.4.1 线性关系考察

精密吸取芦丁标准品溶液，稀释，得不同浓度标准液。分别吸取上述溶液1 μL进样，记录芦丁峰面积。以峰面积为纵坐标(Y)，以溶液浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线。得芦丁回归方程为y=24349x+31.064(r=1.0000，n=6)。结果，表明芦丁在0.16~8.00 mg/mL范围内呈良好线性关系。

2.4.4.2 精密度考察

精密吸取供试品溶液10 μL，连续进样测定6次。结果，RSD值为2.53%。

2.4.4.3 稳定性考察

精密吸取供试品溶液，于 0、3、6、9、12、24 h 分别进样，记录峰面积，结果，RSD为2.04%。

2.4.4.4 重复性考察

取同一批次颗粒，按“2.4.3”项下方法平行制备6份样品，进样，记录峰面积，结果，RSD为3%。

2.4.4.5 加样回收率考察

精密称取已知含量样品6份，分别加入“2.4.2”项下标准品溶液，按“2.4.3”项下处理，进样，记录峰面积并计算加样回收率。结果，芦丁RSD为0.56%(n=6)，表明加样回收率良好。

2.5 二精方颗粒含量测定

取三批次枸杞-黄精颗粒样品，按上述含量测定的方法进行含量测定，计算葡萄糖、甘露糖、芦丁含量，结果见表。根据三批样品的含量测定结果可知，葡萄糖的平均含量为3.94 mg/袋，甘露糖为0.27 mg/袋，芦丁为0.06 mg/袋。

3 讨论

3.1 含量测定指标的选择

二精方颗粒处方中以枸杞和黄精中的多糖类和黄酮类活性成分作为含量测定的主要指标。研究表明，白素芬[10]等

表1 三批样品含量测定结果

人研究二精丸多糖可明显降低糖尿病大鼠血糖、糖化血红蛋白(HbAlc)含量，对糖尿病所引起的“三多一少”等症状有所缓解。王伟[11]等研究表明宁夏枸杞总黄酮能使损伤的人脐静脉内皮细胞抗氧化作用显著提高，对糖尿病引起的心血管疾病具有一定调节功能。除此之外，本研究在前期的实验中，通过建立枸杞-黄精提取物化学成分指纹图谱和谱效关系，确定其共有峰并鉴定出多糖类物质有葡萄糖和甘露糖[12]，黄酮类物质有芦丁；经动物实验确定葡萄糖、甘露糖以及芦丁可能为发挥降糖作用的有效成分。因此，研究通过测定样品中葡萄糖、甘露糖、芦丁的含量来对二精方颗粒的质量进行控制，并进行方法学考察。结果显示，该方法稳定可行。

3.2 含量测定结果分析

对3批二精方颗粒样品的含量测定结果显示，葡萄糖的平均含量为3.94 mg/袋，甘露糖为0.27 mg/袋，芦丁为0.06 mg/袋。拟制定含量限度为：二精方颗粒每袋以葡萄糖(C6H12O6)计，不得少于3.9320 mg；每袋按甘露糖(C6H12O6)计，不得少于0.2714 mg。每袋按芦丁(C27H30O16)计，不得少于0.0604 mg。