王嘉文，宋璐，张潇，洪苑浩，袁强华，詹华奎▲

(1.成都中医药大学，四川 成都 610075；2.成都中医药大学附属医院，四川 成都 610072)

肾病综合征(Nephrotic Syndrome，NS)是以大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症及水肿为表现的一组临床症候群，其病理过程为足细胞损伤、肾小管间质炎症和纤维化，继之肾小球硬化和肾功能衰竭[1]。目前的研究发现，NS蛋白尿的发生和足细胞结构的稳定性有关。肾病蛋白(Nephrin)对维持足细胞骨架的稳定性具有重要意义，同时，Nephrin的丢失也是造成蛋白尿产生的关键[2]。糖皮质激素对肾病综合征的疗效确切，然而其毒副作用明显，甚至部分患者出现激素耐药或激素抵抗现象[3]。我们在临床中发现，运用补肾活血祛风方在缓解NS蛋白尿方面疗效显著，且无明显毒副作用，但其作用机理尚不清楚。本实验旨在研究补肾活血祛风方是否通过调节阿霉素肾病大鼠的Nephrin表达而缓解蛋白尿的发生，并且观察阿霉素肾病大鼠肾脏的病理结构改变，探讨其可能的机制，为补肾活血祛风法治疗NS提供实验理论基础。

1 实验材料与设备

1.1 实验药物

补肾活血祛风方，由黄芪45 g，熟地黄15 g，山茱萸20 g，丹参30 g，僵蚕20 g，地龙15 g，蝉蜕10 g，全蝎10 g组成。饮片均购自四川省中药材饮片公司。原生药材和水以质量1∶10的比例备置，武火加热至沸腾后15 min，而后文火熬制60 min，滤出药液；第二次加水量和原生药材以质量1∶8备置，其余方法同上，熬制结束后滤出药渣，2次药液合并，浓缩药液至每毫升含1.15 g 生药。盐酸多柔比星(阿霉素，上海麦克林生化科技有限公司，批号：D807083)，按2 g/L溶于生理盐水中。醋酸泼尼松片(三才石岐制药股份有限公司，批号：H44023869)，按0.4 mg/mL溶于生理盐水。

1.2 实验动物

健康SPF级雄性SD大鼠60只，体质量(200±20)g，购自成都达硕生物公司，动物许可证号：SCXK(川)2020-030。

1.3 主要试剂

尿液总蛋白检测试剂(上海特康科技有限公司，批号：FT-D234163)；白蛋白检测试剂(上海特康科技有限公司，批号：1604101)；肌酐检测试剂(批号：DZ28)、尿素氮检测试剂(批号：DZ012)、甘油三酯试剂(批号：DZ001)、胆固醇试剂(批号：DZ002)均购自浙江伊利康生物技术有限公司；苏木素(北京百灵威科技有限公司，AR级，批号：LM10N13)；伊红(东京化成工业株式会，批号：GL01-GMPC)；Nephrin兔多克隆抗体[北京博奥森生物技术有限公司，1∶100(浓度)，批号：bs-0465R]；山羊抗兔/鼠工作液(北京中杉金桥生物有限公司，批号：SP-9001/SP-9002)；Animal Total RNA lsolation Kit(FOREGENE公司，规格：200次，批号：RE-03014)；PrimeScript RT reagent Kit(宝日医生物技术有限公司，规格：100 Preps，批号：RR047A)。

1.4 主要仪器

全自动生化分析仪(上海特康科技公司，型号：TC6010L)；病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司，型号：XLCU-PHY-Ⅲ)；三目摄像显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司，型号：BA400Digital)；透射电镜(日立公司，型号：JEM-1400PLUS)；实时荧光定量(RT-PCR)仪(美国ThermoFisher仪器有限公司，型号：PIKORed 96)。

2 方法

2.1 动物模型的建立

大鼠适应性喂养4 d后测定24 h尿蛋白定量，小于10 mg的标记选用，共计57只，随机抽取10只大鼠作为空白对照组。其余47只大鼠均两次尾静脉注射盐酸多柔比星(阿霉素)，初次用量为4 mg/kg，第8天注射3.5 mg/kg，空白组同法注射等容积生理盐水。第二次注射盐酸多柔比星3周后，随机从中抽取4只大鼠检测其外周血，以24 h尿蛋白定量大于100 mg、白蛋白降低和血脂升高为造模成功标准。该批次大鼠造模成功，共计45只，死亡2只。

2.2 动物分组及治疗

将造模成功大鼠随机分为模型组、激素组、补肾活血祛风方组、激素+补肾活血祛风方组。空白组不予干预，模型组以1 mL/100 g等体积蒸馏水灌胃，激素组以醋酸泼尼松片混悬液6 mg/(kg·d)灌胃，补肾活血祛风方组以补肾活血祛风方药液17.19 g/(kg·d)灌胃,激素+补肾活血祛风方组上午以泼尼松6 mg/(kg·d)灌胃，下午以补肾活血祛风方药液17.19 g/(kg·d)灌胃，各组大鼠每日定时给药，连续给药4周。

2.3 标本采集

各组大鼠分别在干预4周后检测24 h尿蛋白定量。收集24 h尿液后，腹主动脉采血；摘取大鼠双侧肾脏分别置于3%戊二醛固定液中待电镜检查和免疫组化染色，于10%中性甲醛溶液中待光镜检查和放置于-80℃冰箱中保存备PCR检测。

2.4 观察指标及检测项目

2.4.1 一般情况 每周观察并记录大鼠体质量、毛发、活动情况、水肿状况、排尿情况、饮水摄食情况等。

2.4.2 实验室指标 24 h尿蛋白定量、血脂、肾功能、血清白蛋白等指标。

2.4.3 伊红(HE)染色观察肾组织病理形态 将肾组织置于中性甲醛固定后依次脱水、石蜡包埋、切片；于苏木素和伊红中染色；梯度酒精脱水，二甲苯透明处理，中性树胶封固；光学显微镜下观察肾脏基本病理变化。

2.4.4 电子显微镜检测 先后在3%戊二醛和1%四氧化锇中进行组织固定，梯度丙酮逐级脱水，再用脱水剂和环氧树脂(型号Epon812)进行浸透；后包埋以备切片；醋酸铀及枸橼酸铅双重染色，透射电镜下进行肾脏超微病理学观察。

2.4.5 免疫组化法检测肾组织Nephrin蛋白水平 取肾组织石蜡切片,采用免疫组织化学法检测nephrin蛋白水平，具体操作按照试剂盒说明书进行。采用Image-Pro Plus 6.0图像分析系统测定nephrin蛋白的平均积分吸光度。

2.4.6 Real-time PCR 法检测肾组织Nephrin mRNA表达 取新鲜肾组织PCR检测，引物交由上海生工生物工程技术服务有限公司设计合成，具体操作按照试剂盒说明书进行。使用Thermo Scientific PikoReal软件(Thermo 公司)分析PCR过程各检测样本的CT(Threshold cycle)值。本实验室通过 2-△△CT计算 X 相对 mRNA 表达水平。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 一般情况

与空白组比较，模型组大鼠皮毛干枯，活动下降，尾部不同程度溃烂，摄食量减少，体重增速减慢，腹腔积液，近一半造模大鼠出现不同程度门齿松动或断裂。与模型组对比，各干预组大鼠一般情况有所改善，激素组出现明显狂躁兴奋、大量腹腔积液。补肾活血袪风方组和激素+补肾活血袪风方组大鼠体重增加较泼尼松组轻。

3.2 实验室指标

3.2.1 各组大鼠尿蛋白比较

造模后，各造模组大鼠24 h尿蛋白定量明显高于空白组(P<0.05)，说明造模成功；干预4周，与模型组比，各干预组蛋白尿定量均降低(P<0.05)；与激素组和补肾活血袪风方组比较，激素+补肾活血袪风方组蛋白尿定量更低，差异有统计学意义(P<0.05)；激素组与补肾活血袪风方组比，尿蛋白没有明显降低，差异无统计学意义(P>0.05)(见表1)。

表1 各组大鼠24 h尿蛋白定量

3.2.2 干预4周后各组大鼠生化相关指标

各组大鼠血Cr差异无统计学意义(P>0.05)。与空白组比，各组Alb降低(P<0.05)，模型组和补肾活血袪风方组BUN降低(P<0.05)，各组TC、TG升高(P<0.05)。与模型组比，激素组TC和TG升高(P<0.05)，其余两组TC和TG降低(P<0.05)。与激素组比，补肾活血袪风方组和激素+补肾活血袪风方组TG和TC降低(P<0.05)，且后两组在降血脂方面无明显差异(P>0.05)(见表2)。

表2 干预4周各组大鼠生化指标

3.3 各组大鼠肾脏组织Nephrin免疫组化染色结果

与空白组相比，模型组大鼠肾组织Nephrin蛋白水平明显降低，具有显著统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，各组大鼠肾组织Nephrin蛋白水平均无明显变化，不具有统计学意义(P>0.05)(见表3，图1)。

表3 各组大鼠肾组织Nephrin蛋白平均光密度

3.4 PCR检测各组大鼠4周末肾组织Nephrin mRNA表达变化

与空白组相比，各组大鼠肾脏组织中Nephrin mRNA表达明显降低(P<0.05)。与模型组相比，各干预组大鼠肾脏组织中Nephrin mRNA表达均升高(P<0.05),激素+补肾活血袪风方组在升高Nephrin mRNA表达上最优。补肾活血袪风方组与激素组比，Nephrin mRNA表达无明显升高(P>0.05)(见表4，图2)。

表4 大鼠肾脏组织Nephrin mRNA表达

3.5 各组大鼠肾脏病理改变

3.5.1 HE染色肾组织病理光镜观察

干预4周观察结果：空白组大鼠肾单位结构正常，无肿大现象，无炎性细胞浸润及纤维化改变。模型组可见肾小球肿大，部分毛细血管基膜略增厚；肾小管上皮细胞水肿变性部分扩张内有蛋白样物质沉积；肾间质内可见纤维组织增生，伴有不同程度的炎细胞浸润。与模型组比较，各干预治疗组肾小管上皮细胞变性，肾间质纤维组织增生、炎细胞浸润等症状均有不同的改善(见图3)。

3.5.2 电镜观察

空白组肾小球足细胞足突形态正常无融合，基底膜结构清晰，无电子致密物沉积。模型组足突广泛融合或消失，肾小球内皮细胞核染色质聚集。各干预组组足细胞融合减轻，多呈节段性融合。其中，激素+补肾活血袪风方组的足细胞病变缓解较补肾活血袪风方组和激素组佳(见图4)。

4 讨论

NS属本虚标实之证，虚以脾肾虚损为主，疾病迁延日久，正气愈虚，易与瘀血、湿热、风邪等毒邪郁结，故在外可表现为水肿、舌暗、烦热等实证[4-5]。尿中蛋白为体内水谷精微转化所得，受肾之封藏。当外风犯肺，子病及母，肾失固摄，而风为阳邪，易袭阳位，则精微下注。此外，久病伤肾，肾水不足以制心火，内灼阴液，致肝肾阴虚，肝风内动，风性开泄致精微外泄[6-9]。故以“补肾活血”为基本治法，注重“风”邪的危害，以“扶正防风，祛风透邪”为治疗思路。方中黄芪、熟地黄，补益脾肺、填精益髓，主入肾经，共同为君药；山茱萸补益肝肾、固涩滑脱，丹参活血养血而性微寒尤适合瘀血兼夹湿热之证，二者相和补而不滞，共为臣药；地龙、全蝎、蝉蜕、僵蚕皆为虫类药长于祛风透邪、通络散结，又可入络搜风，在降蛋白尿方面疗效确切[10-13]，又可增强丹参活血化瘀之效，共为佐药。

阿霉素大鼠肾病模型，经证实类似于人类微小病变性肾病(Minimal Change Disease，MCD)[14]。本实验发现，造模成功后大鼠纳差症状明显，导致摄入蛋白不足，可能是BUN和Cr下降的一个原因，随着药物干预，大鼠食欲好转，出现了BUN和Cr的略微升高。此外，在临床中Cr的改变在疾病早期不显著，也与本实验结果一致。此外，阿霉素肾病大鼠可发生脂代谢紊乱，使用激素后可加重这一症状，激素组出现了明显血脂紊乱，而补肾活血袪风方可改善血脂紊乱，甚至可逆转激素导致的血脂紊乱。补肾活血袪风方对阿霉素肾病大鼠活动、进食等一般情况的效果优于激素组，且纠正激素副作用。研究表明，黄芪、熟地黄和山茱萸在降脂调脂方面疗效显著，可降低血细胞聚集指数、纤维蛋白原水平、血细胞黏滞度[15-16]。尿蛋白是NS低蛋白血症发生的一个主要原因，本实验表明，随着疾病的进展，尿蛋白随之增加，单用激素或单用补肾活血袪风方，可一定程度延缓尿蛋白增加并且两者的疗效无明显差异，而激素+补肾活血袪风方组在短期内的疗效最优。低蛋白血症会增加NS患者血栓栓塞和感染风险，方中丹参抑制血小板的聚集,并可延长凝血时间,改善患者的高凝状态[17]。阿霉素肾病大鼠的光镜和电镜病理变化在早期类似MCD，后期肾小球有逐渐向慢性硬化性发展的趋势。我们发现，光镜下各干预组与同期模型组相比肾小管和集合管中蛋白样物质较少，肾间质纤维化、小管细胞肿大、炎细胞浸润均有缓解。电镜下模型组足突广泛融合消失，而各干预组观察到足突病变好转，但可见节段性融合，其中激素+补肾活血袪风方组的足细胞病理缓解最佳。

Nephrin是位于足细胞裂孔隔膜的跨膜蛋白，对于维持基底膜的稳定性有重要意义[18]。研究表明，NS患者尿Nephrin升高，局灶节段性肾小球硬化患者尿Nephrin水平更甚[19]。在阿霉素大鼠足细胞中Nephrin蛋白表达明显低于正常大鼠[20]。我们的研究结果显示，各干预组Nephrin蛋白表达均无明显差异。因此，我们进一步研究肾组织内Nephrin mRNA的水平。PCR结果显示，各干预组Nephrin mRNA的升高与模型组比较有统计学意义，其中激素+补肾活血袪风方组的Nephrin mRNA的升高最为显著，且其24 h尿蛋白结果与PCR Nephrin mRNA表达呈负相关，说明Nephrin在维持肾小球毛细血管壁完整性，防止白蛋白流失有重要意义，也说明激素+补肾活血袪风方的干预对Nephrin的表达有促进作用。24 h尿蛋白定量、PCR Nephrin mRNA表达与肾脏电镜和光镜联合观察表明，肾小球结构受损程度与蛋白尿排泄量呈正相关，与PCR Nephrin mRNA表达呈负相关，这可能与药物干预后降低Nephrin磷酸化水平有关。

综上所述，激素联合补肾活血袪风方在治疗NS中的疗效确切，对Nephrin表达有正向调节作用，并且补肾活血袪风方对脂代谢紊乱和激素导致的副作用有缓解作用。此外，单独使用激素或补肾活血袪风方的疗效在短期内难分伯仲，可能与实验周期短有关，日后我们将尽可能延长试验周期，以获得更可观的实验数据。