张承舜，张寒潇，曹新，吕鹏，朱莉娟，余曙光

(成都中医药大学 针灸推拿学院/第三附属医院，四川 成都 610075)

心血管疾病在全世界范围内造成高死亡率和严重的经济负担，2019年全球有5.23亿心血管病患者，其中死亡人数为1860万，占全球总死亡人数的三分之一[1]。血脂异常是导致心血管疾病的重要因素，促进动脉粥样硬化、心律失常、糖尿病、阿尔茨海默病等慢性疾病的发生发展[2]。我们的动物实验显示[3]，12周高脂肪、高胆固醇饮食能够诱导载脂蛋白E基因敲除(Apolipoprotein E-deficient,ApoE-/-)小鼠出现自发性室上性心律失常，发生率为60%。自主神经系统失衡与心律失常的发生密切相关，自主神经系统由交感神经和迷走神经组成。交感神经系统过度兴奋会增加细胞内Ca2+浓度,导致钙超负荷，出现心律失常[4]。心率变异性(Heart Rate Variability,HRV)是用于评估连续心跳之间的时间变化的一种非侵入性测量方法[5]，能够反映交感神经系统和副交感神经系统状态。HRV分析主要分为时域分析(Time-Domain Analysis)、频域分析(Frequency-Domain Analysis)和非线性分析(Non-Linear Analysis)，通过以上三种分析参数能够量化HRV，在临床HRV测量中，HRV低值能够反映不良心血管事件，与心律失常和死亡率升高有关[6]，目前关于血脂异常导致心脏自主神经功能紊乱的研究渐受关注[7]，既往研究表明针灸疗法影响自主神经功能[8]，本研究以内关和足三里为代表，以期明确其对高脂血症诱导心律失常自主神经功能的调节作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

1.1.1 实验动物

59只7周龄SPF级健康雄性野生型C57BL/6J小鼠及相同背景ApoE-/-小鼠，体质量(22±2)g，由江苏集萃药康生物科技有限公司提供，生产许可证号：SCXK(苏)2018-0008。所有小鼠饲养于四川省针灸与时间生物学实验室独立通气笼(Individual Ventilated Cage,IVC)系统，自由获取食物与饮水，恒定温度(23±1)℃，相对湿度：40%～50%，光暗周期12 h∶12 h。

1.1.2 动物分组

适应性喂养1周后，将野生型C57B6/J小鼠作为空白组(n=11)，给予SPF维持饲料。将ApoE-/-小鼠随机分为模型组(n=10)，针刺内关组(PC6+针，n=8)，针刺足三里组(ST36+针，n=10)，艾灸内关组(PC6+灸，n=10)，艾灸足三里组(ST36+灸，n=10)，给予12周高脂饲料(1.25%胆固醇，20.35%脂肪)喂养，实验动物饲料均由四川省成都达硕实验动物有限公司提供。动物实验方案通过成都中医药大学动物实验伦理委员会批准(伦理编号：2018-11)。

1.2 主要材料与仪器

一次性无菌针灸针(环球牌；规格：0.25 mm×0.25 mm×13 mm；生产批号：181020)；自制小鼠固定装置(专利号：ZL201920957720.5)；自制小鼠前肢艾灸装置(专利号：ZL201920958794.0)；自制小鼠后肢艾灸装置(专利号：ZL201920976758.7)；艾条(湖南省临湘市湖香艾生物科技有限公司；规格：0.5 mm×0.5 mm×18 cm；特殊订制产品)，5 mL一次性无菌注射器针头(浙江京环医疗用品有限公司；生产批号：20180219P75)。

Powerlab数据采集分析系统、LabChart 8.2.3心电图记录软件(AD Instruments；澳大利亚)，R500小动物麻醉机(瑞沃德生命科技有限公司；中国深圳)、异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司；中国深圳)。

1.3 内关、足三里选穴

参照《实验针灸学》“常用动物针灸穴位及图谱”[9]选取小鼠双侧内关穴，内关穴位于前肢内侧，腕关节上方0.3 cm处的桡、尺骨间；足三里穴位于膝关节下方，腓骨小头下0.3 cm处的肌沟中。

1.4 动物治疗

针刺组与艾灸组从高脂饲料喂养第1天开始针刺或艾灸干预。将小鼠固定在本课题组自行设计的小鼠固定装置上，暴露双侧内关穴，采用一次性无菌针灸针，直刺进针1～2 mm；采用相同规格针灸针，将小鼠固定在本课题组自制专利后肢艾灸装置上，针刺双侧足三里穴，直刺进针约3 mm；针刺内关与针刺足三里组均留针30 min，1次/d，连续针刺5 d，共治疗12周。将艾灸内关组小鼠捆绑固定于小鼠固定装置上，在小鼠前肢艾灸装置上固定艾条，与内关穴皮肤保持1～1.5 cm距离；将艾灸足三里组小鼠固定后，在小鼠后肢艾灸装置上固定艾条，与足三里穴皮肤保持1～1.5 cm距离；艾灸组均施灸30 min，1次/d，连续艾灸5 d，共治疗12周。空白组和模型组小鼠采取相同方式抓取及相同时间固定。

1.5 心率变异性测定方法

结束12周干预后，对所有小鼠进行二导联心电图检查，预先去除交流电干扰。打开PowerLab 数据采集系统、LabChart 8.2.3心电图记录软件、小动物麻醉机，从将小鼠放入动物麻醉诱导盒开始计时，采用3%异氟烷吸入麻醉，待小鼠完全麻醉后，将其转移到心电图记录平台上，同时通过面罩以1%异氟烷维持麻醉。提捏小鼠右侧前肢、右侧后肢、左侧后肢处皮肤，分别插入5 mL一次性无菌注射器针头，分别将接有负极、地线、正极的电极夹在注射器针柄处。所有的电极设置和系统调整在5 min内完成，采用PowerLab数据采集分析系统进行20 min的心电图数据采集。数据采集完成后，为了统一标准，减少干扰和误差，在数据分析时，选取15～20 min内5 min稳定心电图，在LabChart 8 软件中HRV模块对连续RR间期进行时域分析、频域分析、非线性参数分析，包括正常RR间期的标准偏差(Standard Deviation of Normal R-R Intervals，SDNN),连续差异均方根(TheRoot Mean Square of Successive Differences，RMSSD),总功率(Total Power),极低频(Very Low Frequency，VLF),低频(Low Frequency，LF),高频(High Frequency，HF),LF/HF,瞬时节拍变异性的标准偏差(Standard Deviation of Instantaneous Beat-to-BeatVariability，SD1),连续R-R间期的长期标准偏差(Long-term Standard Deviation of Continuous R-R Intervals，SD2),SD1/SD2，绘制HRV Classifier Plot散点图，采用逆向回放对电脑自动分析下的散在散点进行人工识别和伪差去除，以确保选择区间内RR间期的真实性。

2 数据统计分析

3 结果

采用高脂饮食喂养ApoE-/-小鼠12周，发现模型组心律失常成模率为60%。

3.1 各组小鼠心率变异性Classifier Plot散点图的比较

空白组小鼠复杂性与RR间期分别在0.72～0.87 ms、148～168 ms范围内波动，散点集中，无异位搏动；模型组小鼠复杂性与RR间期分别在0.65～1.4 ms、120～164 ms范围内波动，散点分散、跨度大，出现异位搏动(图1)。

注：横坐标代表RR间期，纵坐标代表复杂性(Complexity)，蓝色散点代表正常心率，红色散点代表心律失常

针刺内关组小鼠复杂性与RR间期分别在0.66～0.92 ms、127～148 ms范围内，与模型组相比，散点更为集中、跨度更小，无心律失常；针刺足三里组小鼠复杂性与RR间期分别在0.62～0.83 ms、160～176 ms范围内，与模型组相比，散点更为集中，无异位搏动，与针刺内关组相比，RR间期更小(图2)。

图2 针刺内关组、针刺足三里组小鼠代表性心率变异性散点图

艾灸内关组小鼠复杂性与RR间期分别在0.64～0.87 ms、132～164 ms范围内，与模型组相比，散点更为集中、跨度更小，无异位搏动；与针刺内关组相比，复杂性更为集中，而RR间期较为分散。艾灸足三里组小鼠复杂性与RR间期分别在0.64～0.82 ms、148～172 ms范围内，与模型组相比：散点更为集中，无异位搏动；与针刺足三里组相比，RR间期较为分散(图3)。

图3 艾灸内关组、艾灸足三里组小鼠代表性心率变异性散点图

3.2 各组小鼠时域分析的比较

12周干预后，与空白组相比，模型组SDNN显著降低(P<0.001)，差异具有统计学意义。与模型组相比，针刺内关及艾灸内关组对SDNN均呈现增加的趋势(P=0.076或P=0.053)。与空白组相比，模型组RMSSD呈现出降低趋势(P=0.071)。

3.3 各组小鼠频域分析的比较

12周干预后，与空白组相比，模型组Total Power、VLF、LF、HF均显著降低(P<0.05或P<0.01)，差异具有统计学意义。与模型组相比，针刺内关及艾灸内关组VLF均显著增加(P<0.05)，差异具有统计学意义。与针刺内关相比，针刺足三里组VLF显著降低(P<0.05)，差异具有统计学意义。

注：模型组与空白组比较，***P<0.001；空白组(n=11)，模型组(n=10)，针刺内关组(n=8)，针刺足三里组(n=9)，艾灸内关组(n=10)，艾灸足三里组(n=10)

注：模型组与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；针刺内关组与模型组比较，#P<0.05；艾灸内关组与模型组比较，†P<0.05；针刺足三里组与针刺内关组比较，△P<0.05。空白组(n=11)，模型组(n=10)，针刺内关组(n=8)，针刺足三里组(n=9)，艾灸内关组(n=10)，艾灸足三里组(n=10)

3.4 各组小鼠非线性分析的比较

表1 各组小鼠非线性参数

12周干预后，与空白组相比，模型组SD2显著降低(P<0.001)，差异具有统计学意义。与模型组相比，针刺内关组及艾灸内关组SD2均显著增加(P<0.05)，差异具有统计学意义。

4 讨论

本研究在高脂饲料喂养的ApoE-/-小鼠中观察到血脂异常导致的自主神经功能变化，与以往单纯研究心律失常的普通饮食组相比，高脂肪、高胆固醇造成的心律失常能更好地模拟实际生活中由于血脂升高导致的心血管慢性病变，表现为HRV降低，交感神经和迷走神经均抑制。并且在本研究中对比了刺激方法(针刺及艾灸)的不同，以及经穴特异性(内关与足三里)，发现与空白组相比，模型组HRV参数整体显著下降，表现为总体RR间期的估计值SDNN、Total Power、VLF、LF、HF、SD2显著下降，而针刺或艾灸内关穴刺激能够显著升高部分HRV参数(VLF、SD2)，使交感神经和迷走神经均兴奋；并且针刺内关效果优于艾灸内关效果，而足三里刺激无改善HRV作用。

高脂血症造成病理产物堆积，阻滞心脉，使脏腑功能受损，可导致心律失常的发生，使患者生活质量下降，增加死亡率，造成沉重的医疗负担。在ApoE-/-小鼠中，高脂饮食导致的血脂异常造成心电图变化，表现为心率加快、P波时限增长及QTc延长，并且捕捉到心律失常[3]。HRV来自交感神经系统和副交感神经系统的相互竞争，通过测定心脏自主神经系统的状态，反映生理状态和心律失常、心肌梗死以及心源性死亡等病理状态。既往研究表明[10]，胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平增高的患者HRV降低，并且冠心病死亡率增加。针对无心脏病受试者短期HRV(5～10 min)的调查显示[11]，RMSSD和Total Power都与LDL-C成反比(P<0.01)。给予无冠状动脉疾病的家兔高胆固醇饮食，发现家兔出现心肌肥厚和心脏交感神经增生，同时心室颤动的易损性增加[12]；HRV分析发现：在室性心律失常发作前30分钟交感神经活动增加[4]。此外，HRV降低和心律失常及心血管疾病致死率存在关联性，其预测价值独立于传统的临床风险分层因素[13]。与不易感室颤的动物相比，在运动期间，易感心室颤动的动物的HRV减少更多[14]。随访研究表明[6]，在114例死亡病例中，有约66%的死者(75/114)患有心律失常，幸存者和死者之间的HRV时域和频域参数以及非线性动力学指标有显著差异[13]。在本研究中使用的ApoE-/-小鼠在高脂饮食的喂养下，易出现动脉粥样斑块，同时我们观察到模型组整体HRV降低，时域分析指标SDNN显著降低(P<0.001)，RMSSD呈现出降低趋势(P=0.071)，结合Classifier散点图能够看出，模型组RR变化更大，散点分散、跨度大，并且出现心律失常，表明低HRV可能与血脂异常升高有关。

针灸疗法治疗心血管疾病历史悠久，针灸对自主神经具有调节作用。通过刺激正中传入神经(内关穴)可改善猫交感神经兴奋引起的心肌缺血；在临床试验中，心脏复律后接受针刺治疗的患者的房颤复发率更低，与接受抗心律失常药胺碘酮治疗的患者相似，针刺还能显著减少阵发性房颤患者的症状性房颤发作次数和持续时间[4,15]。在本研究中针刺内关(P=0.076)或艾灸内关(P=0.053)呈现出改善SDNN的趋势，说明针刺或艾灸可能从改善HRV指标达到降低心律失常的目的，内关穴刺激作为一种正中神经刺激，能够通过调节高脂血症诱导的HRV异常，起到降低心律失常，保护心脏的作用。

在本研究中，与空白组相比，模型组Total Power、VLF、LF和HF等频域分析参数都呈现降低趋势。在频域分析中，VLF与全因死亡率的相关性比LF或HF更强[16]，VLF降低反映迷走神经抑制，而交感神经阻滞不影响VLF，VLF还受到运动、体温和肾素-血管紧张素-醛固酮系统的影响[16]。在本研究中，与空白组相比，模型组VLF显著降低，表明模型组的潜在心律失常发生风险更高(P<0.01)，而针刺或艾灸内关后，VLF显著降低(P<0.05)，说明针刺或艾灸内关能够通过升高VLF，降低心血管不良事件的发生，但足三里刺激不能得到相同的结果，说明内关穴刺激在治疗高脂血症诱导的心血管疾病上效果优于足三里。在血脂异常升高导致的心律失常小鼠中，与空白组相比，模型组LF和HF均显著降低(P<0.05)，而针刺对LF有升高的趋势(P=0.062)。表明模型组交感神经和迷走神经均受到抑制，而针刺主要对交感神经产生影响。罗丽平等[17]观察针刺“内关+间使”对健康人HRV的影响，发现针刺5min时HF升高，LF/HF降低，说明针刺的即刻效应主要兴奋迷走神经，而与本研究中的频域分析参数完全相反，说明即刻效应与12周长期针刺对HRV的影响是完全不同的，长期针刺主要兴奋交感神经，而对迷走神经的兴奋作用不强。非线性分析参数SD2与频域分析参数LF相关，在本研究中，与空白组相比，模型组LF与SD2均显著降低(P<0.05或P<0.001)，趋势一致，表明模型组交感神经抑制，针刺或艾灸内关后交感神经兴奋。既往研究显示，SD1与压力反射敏感度相关，但在本研究中各组间SD1差异不显著，说明可能与压力反射敏感度关系不明显。

历代医籍中对饮食导致的血脂异常和肥胖疾病做出论述，清代张志聪在《黄帝内经灵枢集注》中提到“脂”“膏”的来源是由于“蒸津液化”后天水谷导致，精微在外使“皮肉膏肥”，在内使“膏脂丰流”，导致高脂血症的发生。阳明经为多气多血之经，主血所生病，足三里穴为足阳明胃经下合穴，具有通利三焦气血、健脾除痰、消滞助运、化浊降脂的作用，在临床上广泛应用于治疗高脂血症[18]、高血压等心胸疾病。内关穴是治疗心胸疾病的特定穴，同时内关穴传入神经C6～T1与心脏支配神经节段C8～T10部分重叠，内关刺激具有改善自主神经系统功能从而治疗心律失常的作用，但关于刺激内关或足三里穴治疗血脂异常导致心率变异性或心律失常的研究较少。电针内关激活正中神经传入通路，可抑制心肌缺血大鼠的交感神经活性[19]，减少梗死面积，改善心功能和心脏重构，起到与减少交感神经与Ikr电流间相互作用、交感神经切除术和β受体阻滞剂类似的抑制交感作用[20]；电针足三里穴显著改善心力衰竭大鼠压力反射功能和血液动力学参数，与交感神经系统的激活减少有关[21]。在本研究中内关穴刺激发挥主要作用，而足三里穴刺激对HRV参数改善不明显，说明在改善血脂异常诱导的HRV改变上，内关穴具有明显的特异性，足三里对心律失常的作用不如内关有效。足阳明胃经经脉循行经过心胸部，经脉所过，主治所及，故足三里能够治疗心胸疾病，但本研究发现，足三里在血脂异常诱导的HRV改变上的作用不及内关穴，是由于内关穴为心包经络穴、八脉交会穴，对心脏疾病的直接作用优于足三里通过调整气血的间接作用。临床研究[22]使用双侧内关与足三里配合治疗，明显降低患者血脂水平(胆固醇、甘油三酯、LDL-C)，结合本研究显示出：不论是在治疗血脂升高，还是治疗血脂异常诱导的心脏疾病，内关穴具有更明显的作用。

在本研究刺激方法上，针刺优于艾灸，说明机械刺激效果优于温热刺激。心血管系统受到不断变化的机械信号的刺激，包括拉伸、压缩、弯曲和剪切力[23]。针刺作为一种机械刺激，能够降低L型Ca2+通道表达，减少钙离子内流，从而降低家兔快速型心律失常发生率[24]。而艾灸作为一种温热刺激，需要一定的时间-热量的积聚才能达到治疗效果，与38℃艾灸热刺激相比，46℃对心动过缓大鼠的心脏调节作用更大，更能促进穴区局部肥大细胞脱颗粒[25]。本研究结果显示，在治疗血脂等病理产物堆积导致的疾病，宜使用针刺更佳。

本研究以血脂异常诱导心律失常ApoE-/-小鼠作为研究对象，通过内关或足三里穴位刺激观察其HRV变化，发现内关优于足三里，针刺效果优于艾灸，研究结果有助于阐释内关穴刺激对长期高脂血症合并心律失常时自主神经系统的作用，为选取适当的刺激方法及穴位提供借鉴。