刘美秀 冯高华 严正平 梁小红

（江苏省张家港市中医医院，江苏 张家港 215600）

急性肺损伤是危重患者死亡的常见原因，也是危重患者常见的临床症状，主要的临床表现是呼吸衰竭和顽固性低氧血症［1］。急性肺损伤主要的发病机制是多种炎性细胞以及其释放的炎性细胞因子介导的炎症反应，可导致肺泡腔渗出液体、肺微血管通透性增高，进一步导致非心源性肺水肿［2］。肺是机体内含氧量最为丰富的器官，当急性肺损伤发生时，炎症所引起的血管内皮细胞以及肺泡上皮细胞的破坏，使肺通气的换气功能受到影响，肺组织的细胞氧分压会降低，使机体启动低氧反应［3］。肠缺血/再灌注损伤不仅能导致肠道毒素和细菌的移位，还能释放多种肠道氧自由基及炎症因子，造成多种器官功能损伤和全身炎症反应，其最为明显的是肺损伤［4-5］。宣肺通腑方出自《温病条辨》，具有宣肺通腑、清泻热结的功效。本实验将研究宣肺通腑方加减对肠缺血/再灌注肺损伤导致的急性肺损伤模型大鼠的抗炎、抗氧化作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取40只清洁级SD大鼠，周龄6～8周，平均（6.90±0.62）周，体质量200～230 g，平均（215.41±20.60）g，由南京医科大学实验动物管理中心提供，动物许可证号：SCXK（苏）2013-0016。

1.2 试药与仪器 宣肺通腑方，组方：生石膏45 g（先煎），杏仁20 g，知母30 g，大黄10 g，赤芍15 g，瓜蒌30 g，苍术20 g，前胡10 g，芦根30 g，柴胡10 g。水煎后药液离心处理，取出杂质，浓缩至生药含量1 g/mL的水煎液，高温杀菌，4℃保存备用。地塞米松（上海信谊百路达药业有限公司）；酶联免疫试剂盒（南京建成生物工程研究所）；RSE3020动物肺功能仪器（北京贝兰博科技有限公司）；一抗、二抗（兔抗人，武汉博士德生物工程公司）。

1.3 模型制备［6］模型组、地塞米松组、宣肺通腑方组大鼠腹腔注射10%水合氯醛3.5 mL/kg麻醉后，消毒铺巾，正中切口进入腹部，将肠系膜上动脉分离。用无损伤的动脉夹夹闭肠系膜上动脉的根部，阻断30 min后，将动脉夹移开恢复肠道血流。模型成功的标准为缺血处肠系膜微动脉消失，且再灌注前的肠道肿胀、瘀黑，动脉夹移开后缺血处肠系膜微动脉恢复搏动。假手术组仅分离肠系膜上动脉但不夹闭。腹腔内给予含有160 U的庆大霉素9 g/L、生理盐水0.1 mL，缝合腹膜、肌肉及皮肤。再灌注2 h后断颈处死，留取肺标本待检测。

1.4 分组与给药 将大鼠分为假手术组、模型组、地塞米松组、宣肺通腑方组，每组各10只。地塞米松组在建模1 h前腹腔注射5 mg/kg地塞米松。宣肺通腑方组在建模3 d前开始灌胃宣肺通腑方水煎液，每日1次，每次7.5 g/kg。正常组和模型组给予等量无菌生理盐水灌胃。

1.5 肺功能检测 于给药前和造模后，采用RSE3020动物肺功能仪器及AniRes 2005软件分析系统共同测量FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC值。

1.6 标本采集与检测 1）肺组织病理学观察。取石蜡包埋的肺组织标本，10%甲醛固定，切片，常规脱蜡，HE染色。采用双盲法在光镜下观察病理学变化。2）白细胞介素-8（IL-8）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）及血管内皮生长因子（VEGF）水平检测。采用酶联免疫吸附试验检测IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平。3）超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、一氧化氮合酶（NOS）及髓过氧化物酶（MPO）含量检测。取100 mg肺组织，加入2 mL的匀浆介质液配置成5%的肺组织匀浆，进行SOD、GSH-Px、NOS及MPO含量检测。3）Western blotting检测p38、p-p38及p-NF-κB蛋白。将细胞消化吹打后转移至离心管离心，倒去上清，加1 mL PBS打匀，移入EP管，12 000 r/min离心2 min，研磨后加入蛋白缓冲液，进行常规的蛋白提取，BCA法分析蛋白定量。制备50 μg的蛋白样品，上样后SDS-PAGE电泳，通过蛋白电转到PVDF膜，使用5%脱脂奶粉TBST中，封闭避光1 h，洗涤后加入一抗稀释溶液（p38、p-p38及p-NF-κB 1∶1 000比例稀释），4℃环境下过夜保存，洗涤之后加入二抗溶液（p38、p-p38及p-NF-κB 1∶5 000比例稀释），孵育1 h后再次洗涤，加入ECL发光液，使用NIH Image software软件分析蛋白条带灰度值。GAPDH为内参蛋白。

1.7 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（）表示，两组间比较实施独立样本t检验，多组间比较采用F值检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺功能指标比较 见表1。与假手术组比较，模型组、地塞米松组FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平升高，宣肺通腑方组FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平降低（P<0.05）；与模型组比较，地塞米松组、宣肺通腑方组FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平降低（P<0.05）；与地塞米松组比较，宣肺通腑方组FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平降低（P<0.05）。

表1 各组大鼠肺功能指标比较（±s）

表1 各组大鼠肺功能指标比较（±s）

与假手术组比较，∗P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与地塞米松组比较，○P<0.05。下同

组别假手术组模型组地塞米松组宣肺通腑方组n 10 10 10 10 FVC（%）94.76±7.64 99.47±8.13*97.26±7.81*#93.13±6.73*#○TLC（L）94.53±7.43 101.42±9.46*98.29±8.49*#93.34±6.41*#○FEV1（L）96.67±7.83 112.41±9.24*99.16±7.91*#95.21±7.06*#○FEV1/FVC（%）97.61±9.46 120.26±11.43*103.46±10.53*#90.37±8.49*#○

2.2 各组大鼠肺组织病理学观察 见图1。假手术组未见明显的病理改变，肺组织结构正常，偶见渗出物及炎性细胞；模型组有大量的炎性细胞，肺泡腔内渗出物明显；地塞米松组改变轻于宣肺通腑方组，宣肺通腑方组可见明显病理改变，有轻度的渗出物及炎性细胞浸润。

图1 各组大鼠肺组织病理学观察（HE染色，200倍）

2.3 各组大鼠IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平比较见表2。与假手术组比较，模型组、地塞米松组及宣肺通腑方组IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平升高（P<0.05）；与模型组比较，地塞米松组、宣肺通腑方组IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平降低（P<0.05）；与地塞米松组比较，宣肺通腑方组IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平降低（P<0.05）。

表2 各组大鼠IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平比较（±s）

表2 各组大鼠IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平比较（±s）

组别假手术组模型组地塞米松组宣肺通腑方组n 10 10 10 10 IL-8（ng/L）52.49±12.18 114.38±19.14*84.29±10.48*#60.54±10.07*#○TNF-α（pg/mL）15.47±3.54 86.24±14.35*70.27±12.49*#40.24±7.26*#○IL-6（ng/L）34.73±10.42 88.49±13.26*71.49±9.41*#40.37±7.57*#○VEGF（ng/L）78.61±8.45 153.18±21.44*91.16±15.53*#80.15±12.49*#○

2.4 各组大鼠SOD、GSH-Px、NOS及MPO含量比较见表3。与假手术组比较，模型组、地塞米松组及宣肺通腑方组SOD、GSH-Px水平降低，NOS、MPO水平升高（P<0.05）；与模型组比较，地塞米松组、宣肺通腑方组SOD、GSH-Px水平升高，NOS、MPO水平降低（P<0.05）；与地塞米松组比较，宣肺通腑方组SOD、GSH-Px水平升高，NOS、MPO水平降低（P<0.05）。

表3 各组大鼠SOD、GSH-Px、NOS及MPO含量比较（±s）

表3 各组大鼠SOD、GSH-Px、NOS及MPO含量比较（±s）

组别假手术组模型组地塞米松组宣肺通腑方组n 10 10 10 10 SOD（NU/mg）201.24±21.76 71.43±10.64*93.78±11.35*#171.29±17.49*#○GSH-Px（U/mg）49.16±6.73 24.67±4.51*32.43±4.06*#44.34±5.62*#○NOS（U/mg）7.62±1.13 12.63±1.76*11.86±1.34*#8.73±0.93*#○MPO（U/g）1.37±0.16 2.43±0.21*2.21±0.18*#1.78±0.12*#○

2.5 各组大鼠p38/NF-κB蛋白表达比较 见表4，图2。与假手术比较，模型组、地塞米松组p38、p-p38及p-NF-κB蛋白含量升高，宣肺通腑方组p38、p-p38及p-NF-κB蛋白含量降低（P<0.05）；与模型组比较，地塞米松组、宣肺通腑方组p38、p-p38及p-NF-κB蛋白降低（P<0.05）；与地塞米松组比较，宣肺通腑方组p38、p-p38及p-NF-κB蛋白降低（P<0.05）。

表4 各组大鼠p38、p-p38及p-NF-κB蛋白表达比较（±s）

表4 各组大鼠p38、p-p38及p-NF-κB蛋白表达比较（±s）

组别假手术组模型组地塞米松组宣肺通腑方组n 10 10 10 10 p38 0.81±0.26 0.91±0.29*0.83±0.25*#0.71±0.18*#○p-p38 0.93±0.29 1.13±0.31*1.01±0.30*#0.82±0.26*#○p-NF-κB 0.86±0.23 1.02±0.33*0.94±0.28*#0.73±0.21*#○

图2 各组p38、p-p38及p-NF-κB蛋白表达

3 讨 论

急性肺损伤是各种间接及直接致伤因素所导致的毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤，造成弥漫性的肺泡和肺间质水肿，所引起的急性低氧性呼吸功能不全。主要病理生理特征是通气/血流比例失调、肺容积减少、肺顺应性降低［7-8］。肠缺血/再灌注后肺损伤的主要原因是过度炎症反应和氧化应激。肠缺血/再灌注后氧自由基会过度增加，可以随血液播散全身，激发链式脂质过氧化反应，导致脏器功能损伤［9］。

肺功能是呼吸系统疾病的必要检测，主要检测肺容量大小、呼吸道的通畅程度，对检出肺、气道病变，评估病情严重程度及预后，鉴别呼吸困难原因，评定治疗方法等有重要的临床价值［10-11］。本文研究结果显示，与假手术组比较，模型组、地塞米松组FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平升高，宣肺通腑方组FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平降低；与模型组比较，地塞米松组、宣肺通腑方组FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平降低；与地塞米松组比较，宣肺通腑方组FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平降低。说明宣肺通腑方可以降低FVC、TLC、FEV1及FEV1/FVC水平。IL-8可以调节人类生殖生理和病理过程，其作用机制是与特异性受体结合而发挥其作用［12］。TNF-α是能够抑制刺激破骨细胞和成骨细胞的细胞因子，由激活的巨噬细胞产生［13］。IL-6是一种细胞因子，能够参与并刺激免疫反应的细胞分化、增殖且提高其功能［14］。VEGF是一种促进血管内皮细胞生长的因子，具有高度的特异性，还可以促进血管内皮细胞迁移、增殖、血管通透性增加等作用［15］。研究结果显示，与假手术组比较，模型组、地塞米松组及宣肺通腑方组IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平升高；与模型组比较，地塞米松组、宣肺通腑方组IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平降低；与地塞米松组比较，宣肺通腑方组IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平降低。说明宣肺通腑方可以使IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF水平降低。宣肺通腑方改善肺功能可能与方剂所含的药物或成分有关，如吴跃文等［16］报道，增加麻杏石甘汤中的石膏比例，能明显改善患者的肺功能，缓解咳嗽、咯痰、气喘症状，缩短肺部啰音消失时间。王瑞成等［17］认为知母-黄柏药对的30%醇洗物通过抑制NF-κB 信号通路，可降低 LPS诱导的 IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达。大黄素是大黄的主要有效成分，潘书涵等［18］认为其抗炎的机制可能是抑制TNF-α-HIF-1α-iNOS-NO信号通路开放。

SOD是一种抗氧化金属酶，能够催化超氧阴离子自由基歧化生成过氧化氢和氧，在机体抗氧化与氧化平衡中起到关键作用，与很多疾病的发生密不可分［19］。GSH-Px是一种过氧化物分界酶，能够使有毒的过氧化物还原成无氧的羟基化合物，起到保护细胞膜的功能和结构不受过氧化物的损害和干扰［20］。NOS存在于巨噬细胞、神经吞噬细胞、神经细胞和内皮细胞中，具有与原生膜联合和协助细胞通讯的功能［21］。MPO是一种重要的含铁溶酶体，能够导致个体对疾病易感性的差异，与多种疾病的发生和发展密切相关［22］。本文研究显示，与假手术组比较，模型组、地塞米松组及宣肺通腑方组SOD、GSH-Px水平降低，NOS、MPO水平升高；与模型组比较，地塞米松组、宣肺通腑方组SOD、GSH-Px水平升高，NOS、MPO水平降低；与地塞米松组比较，宣肺通腑方组SOD、GSH-Px水平升高，NOS、MPO水平降低。说明宣肺通腑方可升高SOD、GSH-Px水平，降低NOS、MPO水平。类似的研究，如裴晶等［23］证实石膏通过升高SOD活力到抗氧化作用。本文研究显示，与假手术比较，模型组、地塞米松组p38、p-p38及p-NF-κB蛋白含量升高，宣肺通腑方组p38、p-p38及p-NF-κB蛋白含量降低；与模型组比较，地塞米松组、宣肺通腑方组p38、pp38及p-NF-κB蛋白降低；与地塞米松组比较，宣肺通腑方组p38、p-p38及p-NF-κB蛋白降低。说明宣肺通腑方可使p38、p-p38及p-NF-κB蛋白降低。韩正贵等［24］研究显示，宣肺通腑方对肺损伤起到保护作用，其机制能够降低p38、p-p38及p-NF-κB蛋白表达。孙月雯等［25］认为大黄牡丹汤可通过调控TLR/MyD88/NF-κB-p65信号治疗急危重症患者急性肠功能障碍。张银环等［26］研究发现大黄素可剂量依赖诱导肝细胞脂质堆积与炎症损伤，进而损伤细胞，该过程与调整p-NF-κB蛋白表达有关。以上结果证实宣肺通腑方发挥疗效与该方的有效成分紧密相关。

综上所述，宣肺通腑方加减对肠缺血/再灌注肺损伤导致的急性肺损伤大鼠作用明显，能有效改善大鼠肺功能，通过调控p38/NF-κB通路，降低IL-8、TNF-α、IL-6及VEGF而发挥抗炎作用，提高SOD、GSH-Px水平，降低NOS、MPO水平，起到抗氧化作用和治疗急性肺损伤的效果。