陆秀红 黎达境 黄金玲 李红芳 张禹 刘志明

摘  要：为明确广西贺州市栀子根结线虫病病原种类，采集根部有明显根结的栀子根系进行根结线虫分离鉴定，通过观察根结线虫2龄幼虫、雌成虫、会阴花纹特征对其进行形态学鉴定，并利用核糖体ITS区和28S rDNA D2D3区序列比对和系统发育树分析方法对其进行分子生物学鉴定。结果表明，该病原线虫2龄幼虫和雌成虫形态特征及形态测量值与象耳豆根结线虫（Meloidogyne enterolobii Yang  Eisenback， 1983）相似;该病原线虫核糖体ITS区与NCBI数据库中象耳豆根结线虫相应序列的相似度为100%，28S rDNA D2D3区与NCBI数据库中象耳豆根结线虫相应序列的相似度为99%以上;该病原线虫核糖体ITS序列以99%的支持率与象耳豆根结线虫聚为同一分支。综合形态学和分子生物学鉴定结果将广西贺州市栀子根结线虫病病原种类鉴定为象耳豆根结线虫，栀子（Gardenia jasminoides Eills）是该线虫的新寄主纪录。

关键词：栀子;象耳豆根结线虫;种类鉴定

Abstract： In order to clarify the pathogen species of Gardenia jasminoides Eills root-knot nematode disease in Hezhou， Guangxi Province， the root samples with obvious root-knot of G. jasminoides were collected for isolating root-knot nematodes. The pathogenic nematodes were identified by observing the morphological characteristics of females， second-stage juveniles and perineal pattern， sequence alignments， phylogenetic analysis. The results showed that the morphological characteristics and morphometric values of the second-stage juveniles and females were similar to those of Meloidogyne enterolobii Yang  Eisenback. The rDNA-ITS fragment and 28S rDNA D2D3 fragment of the nematode were highly similar to those M. enterolobii in NCBI database， with a similarity of 100% and over 99%， respectively. The rDNA-ITS sequences of the nematode were clustered within the same clade and M.enterolobii with support rate of 99%. Morphological and molecular identification methods identified the pathogen species of G. jasminoides root-knot nematode disease in Hezhou as M. enterolobii. M. enterolobii is the new host for G. jasminoides Eills.

Keywords： Gardenia jasminoides Eills; Meloidogyne enterolobii Yang  isenback; identification

植物寄生线虫（plant parasitic nematodes， PPNs）是制约全球粮食生产的重要因素之一。据统计，全世界因植物寄生线虫造成的损失约800亿美元，其中根结线虫（Meloidogyne spp.）广泛分布于世界各地，是危害极大的一类植物寄生线虫[1-2]。目前根结线虫的防治措施包括种植抗病品种、使用化学杀线剂、轮作、生物防治等，其中线虫种类鉴定是各类防治措施实施的基础[3]。

栀子（Gardenia jasminoides Eills）又名黄栀子，属茜草科（Rubiaceae Juss）栀子属植物，是我国传统的中药材，不仅可以直接入药，其果实还是提取食用色素添加剂“黄色素”的天然优质材料。栀子分布于广西、河南、浙江、江西、福建、湖北等地，种植栀子可促进产地农民增收，是目前广西贺州、柳州等地产业扶贫的有效途径[4]。然而，栀子生产面临严重的病害问题，其中根结线虫病是其中一种重要的病害，在不同地区均有不同程度发生。熊英等[5]、贾全全等[6]、李冬等[7]等相继在广西柳州、江西等地发现该病害，但多数研究集中于病害发生情况调查及药剂筛选方面，病原相关报道较少，仅有广西柳州[5]、福建福鼎[8]两地对其病原进行了鉴定。2018—2020年对广西贺州市的栀子种植基地进行调查，发现栀子受到根结线虫的危害，呈现植株长势差，叶片黄化、萎蔫、根系形成大量根结等症状，严重制约当地栀子种植产业的发展。本研究对采集到的栀子根系及其根际土壤进行分离，对分离得到的根结线虫二龄幼虫及雌蟲进行形态观察及分子生物学鉴定，旨在明确栀子根结线虫病病原种类，为该病的有效治理提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  供试线虫的采集及分离

线虫样本采自贺州市八步区莲塘镇旗头岭（22°491.21 N，108°2159.55 E）文坡村、上寺村栀子种植基地，采用五点取样法挖取呈现根结线虫病症状的栀子根系及其根际土壤带回实验室。在解剖镜下，从根结挑取单卵块放置25 ℃恒温箱孵化成二龄幼虫，将二龄幼虫接种于预先培植于消毒土的栀子（贺栀1号）根部，进行活体保存，待用。试验时挖取根结线虫病症状明显的栀子根系及根际土壤，采用直接解剖法分离雌虫，将根系置于体视镜（NIkon SMZ800N）下用3号昆虫针挑取雌虫进行形态学观察;根际土壤采用改良贝曼漏斗法进行分离，25 ℃静置24 h后，用小玻璃瓶收集约10 mL线虫悬浮液。在体视镜下将根结线虫二龄幼虫从线虫悬浮液中挑出，经热杀死（65 ℃水浴3 min）后制成临时玻片用于形态观察。

1.2  形态学鉴定

二龄幼虫及雌虫主要形态特征：使用尼康显微镜（NIkon Ni-E）观察其头部、口针、尾部特征，并采用de Man公式对20条二龄幼虫进行测量，分别测量体长、最大体宽、口针长度、尾长、透明尾长和DGO（背食道腺开口至口针基部球的距离）等形态指标[9]。

会阴花纹的制作及观察：参照张绍升[10]的方法，从栀子根组织挑取成熟雌虫，放置滴有10 μL 40%乳酸的载玻片上，在体视显微镜下用手术刀切取虫体后部约1/4并将体内组织去除，用镊子将会阴花纹转移至滴有10 μL纯甘油的载玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察拍照。

1.3  分子生物学鉴定

1.3.1  线虫DNA提取  线虫DNA抽提采用单条线虫DNA提取法。参照王江岭等[11]的方法略有改动，在经灭菌的凹面皿上滴入16 μL ddH2O和2 μL 10×PCR Buffer混合液，用挑虫针将单条根结线虫二龄幼虫挑入混合液中，取1号昆虫针将线虫切成2～3段，用移液器将含有线虫段的所有混合液转移至200 μL PCR管中，加入2 μL（1 mg/mL）蛋白酶K，–80 ℃超低温冰箱放置20 min，65 ℃温育60 min，95 ℃加热10 min，获得DNA提取液。DNA提取液可立即用于PCR扩增或放入–20 ℃冰箱保存备用。

1.3.2  PCR扩增  核糖体ITS区采用引物F194： 5-CGTAACAAGGTAGCTGTAG-3和PXB481： 5-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3进行扩增[11]，28S rDNA D2D3区采用通用引物D2A： 5-ACAAGTACCGTGAGGGAAAGT-3和D3B： 5-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3进行扩增[12]。PCR反应体系（50 μL）：TaKaRa Taq HS Perfect Mix （2×） 25 μL，上游引物（10 μm）2 μL，下游引物（10 μm）2 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 19 μL。扩增条件：94 ℃ 4 min;94 ℃ 40 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35个循环;最后72  5 min。PCR产物进行1% Agarose胶电泳检测，PCR产物纯化后，送生工生物工程（上海）股份有限公司双向测序。

1.3.3  序列分析  PCR产物测序结果用NTI 11软件进行序列拼接，最终序列上传至GenBank，序列号分别为MH756121、MH756122、MN648519、MN648520。根据近年来发表的根结线虫系统进化文献，从GenBank下载相关线虫rDNA-ITS和28S rDNA D2D3序列，采用NTI 11软件进行多重序列比对分析。

1.3.4  系统进化分析  采用MEGA 7.0软件构建基于rDNA-ITS及28S rDNA D2D3区的Neighbor- joing系统进化树。分别选择GenBank数据库中象耳豆根结线虫（M. enterolobii）rDNA-ITS序列（MT648507、MT193450、MT193449、MN017119、MN017115、MH800969）和28S rDNA D2D3区序列（MT648507、MT193450、MT193449、MN017119、MN017115、MH800969），南方根结线虫（M. incognita）rDNA-ITS序列（LC030363），花生根结线虫（M. arenaria）rDNA-ITS序列（KJ572384、AF387092）和28S rDNA D2D3區序列（AF435803、KJ598135），爪哇根结线虫（M. javanica）rDNA-ITS序列（AY438555、KX646187）和28S rDNA D2D3区序列（MT3412999、MN096736），巴拉那根结线虫（M. paranaensis）28S rDNA D2D3区序列（AF435800、KY911103），拟禾本科根结线虫（M. graminicola）28S rDNA D2D3区序列（MG273441、MG273443），分别以朱顶红短体线虫（Pratylenchus hippeastri， FJ712935）和玻利维亚短体线虫（P. crenatus， MH973647）作为外类群，rDNA-ITS共计15条序列，28S rDNA D2D3区共计17条序列构建系统进化树，以自展法（bootstrap）进行1000次循环检测[13-14]。

2  结果与分析

2.1  栀子根结线虫病症状

调查发现贺州市栀子种植基地部分栀子出现植株矮小，叶片黄化失绿，生长缓慢，严重的整株枯死等症状。受害植株根部形成大小不一的根结，根部表面坏死呈疏松孔状（图1）。取根组织在体视显微镜下观察可见大小不一的卵囊，切开卵囊见椭圆形卵块，根结组织内发现梨形的雌虫。采用改良贝曼漏斗分离根际土壤可分离到大量根结线虫二龄幼虫。

2.2  形态学特征

雌虫：虫体乳白色，梨形;颈部突出，与体分界明显;阴门和肛门位于末端;会阴部为指状花纹;侧尾腺口点状，位于肛门两侧靠前位置;口针细长，椎体部向背面略弯曲与杆部等长;口针基部球较小，形成两个球状。中食道球卵圆形，瓣门近似圆形;排泄孔位于中食道球前口针基部稍后位置（图2A）。会阴花纹近卵圆形或椭圆形;背弓较高，线纹较细且平滑，外侧线纹呈波浪状;具1～2条不太明显侧线;阴门裂较长，阴肛区无线纹;腹面线纹纤细光滑，尾部较明显（图2B）。

二龄幼虫：线形，身体体环清晰明显，头架骨化弱，唇区缢缩不明显;排泄孔位于半月体后;口针细长，基部较大且为圆球形;中食道球卵圆形;尾部透明區分界明显，尾部缢缩明显，尾尖钝圆或细圆（图3），其测量值见表1。

本研究中广西贺州种群形态特征和测量值与象耳豆根结线虫（M. enterolobii）原始报道基本一致，故定为象耳豆根结线虫[15]。

2.3  分子特征

利用通用引物F194/PXB481和D2A/D3B分别对二龄幼虫核糖体ITS区域及28S rDNA D2D3区进行扩增，得到约700 bp的片段，PCR产物扩增如图（图4）。经双向测序和拼接获得ITS片段大小为757 bp，GenBank登录号为MH756121、MH756122，与国内报道的福建、湖南、海南及越南象耳豆根结线虫（M. enterolobii）群体的序列相似度是100%;与近似种南方根结线虫（M. incognita）ITS（MH113856）的序列相似度为90%，与花生根结线虫（M. arenaria）ITS序列（LC030356、LC030350）的序列相似度分别为88%和90%;与爪哇根结线虫（M. javanica）ITS序列（AY438555、KX646187）的序列相似度均为88%。扩增的28S rDNA D2D3区片段大小分别为764 bp和716 bp，GenBank登录号为MN648519和MN648520，其中MN648520与国内报道的广东、福建，及美国、泰国象耳豆根结线虫（M. enterolobii）群体的序列相似度为100%，MN648519与美国象耳豆根结线虫（M. enterolobii）群体的序列相似度为100%，和中国福建、广东及泰国象耳豆根结线虫（M. enterolobii）群体的序列相似度为99%;MN648519与近似种花生根结线虫（M. arenaria）和爪哇根结线虫（M. javanica）D2D3区片段（AF435803、MT3412991）的序列相似度均为94%;MN648520与花生根结线虫（M. arenaria）和爪哇根结线虫（M. javanica）D2D3区片段（AF435803、MN096736）的序列相似度分别为95%和94%。该结果进一步表明该病原线虫为象耳豆根结线虫（M. enterolobii）。

2.4  系统进化树分析

对基于核糖体ITS和28S rDNA D2D3区构建的系统进化树进行分析发现，基于ITS基因序列的进化树中，栀子根结线虫种群MH756121、MH756122与海南（KF418369、MT0675599）、越南（MG773551、MG773550）、福建（MT209951、KX823380）、湖南（MT456216）7个象耳豆根结线虫（M. enterolobii）群体位于同一分支，支持率为99%。基于28S rDNA D2D3基因序列的进化树中，栀子根结线虫种群MN648519、MN648520与泰国（MT648507）、中国福建（MT193450、MT193449）、中国广东（MN017119、MN017115）、美国（MH800969）6个象耳豆根结线虫（M. enterolobii）群体位于同一分支上，支持率为85%。此外，基于核糖体ITS和28S rDNA D2D3区域构建的系统进化树中，栀子根结线虫种群均与南方根结线虫（M. incognita）、花生根结线虫（M. arenaria）、爪哇根结线虫（M. javanica）、拟禾本科根结线虫（M. graminicola）等近似种聚类在不同的分支，能明显与近似种区分开（图5，图6）。该结果进一步证实该病原线虫为象耳豆根结线虫（M. enterolobii）。

3  讨论

本研究对广西贺州市栀子种植基地的根结线虫病进行了调查，发现栀子根结线虫病发生较严黑体为新获得的序列标记。本研究采用形态学结合分子生物学的方法，将其病原鉴定为象耳豆根结线虫（M. enterolobii），为栀子根结线虫病的诊断及防治奠定了基础。

根结线虫病是栀子生产面临的一种重要病害，广东[16]、福建[8]、江西[6-7]等地相继报道了该病害，但多数研究集中于病害发生情况调查及药剂筛选方面，病原相关报道较少，仅有广西、福建两地对其病原进行了鉴定。2008年，熊英等[5]采用形态学的方法将广西柳州市鹿寨县黄栀子种植基地根结线虫病的病原鉴定为南方根结线虫（M. incognita）。福建省林业职业技术学院和福建省林业科学院将该省栀子根结线虫病的病原鉴定为花生根结线虫（M. arenaria）[8]。根结线虫分布广且种类繁多，该属有近100个有效种，同种作物不同地区其优势种群有差异[1]。许天委等[17]研究发现海南省土沉香根结线虫病的病原为南方根结线虫（M. incognita）、花生根结线虫（M. arenaria）、爪哇根结线虫（M. javanica ），其中南方根结线虫（M. incognita）是优势种群;而苏圣淞等[18]对海南澄迈土沉香根结线虫病病原鉴定发现其病原为象耳豆根结线虫（M. enterolobii）。本研究对广西贺州市栀子根结线虫病的病原进行鉴定发现其病原为象耳豆根结线虫（M. enterolobii），这样的结果并不矛盾。本研究在之前形态学鉴定的基础上结合了分子生态学特征进行分析，其结果具有更高的准确性。

1983年，Yang等[15]在我国海南省儋州市象耳豆树上首次发现并报道象耳豆根结线虫（M. enterolobii），此后许多国家相继报道了该线虫的发生，到目前为止发现象耳豆根结线虫（M. enterolobii）广泛分布于四大州的热带地区[19]。在我国，海南省[20]的三亚、琼海、定安，广东省[21]的番禺、遂溪，福建省[22]的福州、漳州，湖南永州[23]等地均发现了该线虫。研究发现该虫可危害中药材、蔬菜、果树等经济作物造成严重的经济损失，本研究发现的茜草科栀子是该线虫的寄主新记录。卓侃等[21]认为该线虫寄主范围广、毒性强、危害大，是热带、亚热带地区重要的病原线虫。广西地属亚热带地区，广泛种植的西瓜、番茄、番石榴等作物均是象耳豆根结线虫的寄主，开展该线虫的调查，了解其分布情况及新的潜在寄主，可为有效采取检疫和防治措施，防止该病原线虫的传播扩散及危害提供必要的依据。

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责任编辑：谢龙莲