黄 浩，翁 霞

(1.北京联创种业有限公司 北方事业部，北京 100020；2.鞍山师范学院 化学与生命科学学院，辽宁 鞍山 114007)

玉米黄色素在自然界中分布广泛，主要由玉米黄素、叶黄素和隐黄素组成，是一种具有多重保健功能的天然食用色素[1].玉米黄色素具有抗氧化、改善老年黄斑病变、治疗白内障、预防癌症、预防心脑血管疾病的作用.在食品工业中，玉米黄色素作为天然食品色素逐渐取代柠檬黄和日落黄等合成色素，1996年被列为允许添加食用的天然色素之一.《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》(GB 2760-2014)中，玉米黄色素的最大添加量为5.0 g/kg[2]，因此，玉米黄色素作为功能性成分具有广阔的市场前景，其提取研究也逐渐成为热点.

目前，提取玉米黄色素的方法主要有有机溶剂浸提法[3]、索氏提取法、超声波法[4-5]、超临界流体萃取法[6]等多种.酶法是利用酶的水解效应专一性地破坏玉米细胞的细胞壁[7]，超声波法是利用机械作用和乳化效应破坏玉米细胞的细胞壁[8]，而将酶法和超声波法结合使用比较少见.该法利于玉米黄色素的溶出，为玉米黄色素的提取开辟了一条新的途径.

1 材料与方法

1.1 材料与设备

玉米：市售，购于鞍山市某超市.

无水乙醇(天津市光复精细化工研究所)；纤维素酶、木瓜蛋白酶(北京奥博星生物技术有限责任公司).无水乙醇为分析纯，其余试剂均为生物纯.

UV-110型紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)；PL2002电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)；BSA-CW电子天平(万分之一天平)(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；HH-4数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司)；FZ102微型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；80-2B台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；KQ5200B超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司).

1.2 主要方法

1.2.1 玉米黄色素的提取 称取5.00 g玉米，粉碎40 目后，加入60%乙醇配制的1.4%的纤维素酶液30 mL，55 ℃水浴2 h后，放入超声装置中，55 ℃超声15 min取出，4 000 r/min离心10 min，样品提取液稀释后，于可见分光光度计400～800 nm吸收波长下扫描，玉米黄色素的最大吸收波长为445 nm，以下测定均在该波长进行.

1.2.2 玉米黄色素的酶法提取 称取5.00 g玉米，粉碎40 目后，分3种情况进行提取：(1)60%乙醇30 mL，55 ℃超声15 min；(2)60%乙醇配制的1.4%的纤维素酶液30 mL，55 ℃水浴2 h；(3)60%乙醇配制的1.4%的木瓜蛋白酶液30 mL，55 ℃水浴2 h.分别将样液取出，4 000 r/min离心10 min，样品提取液稀释后于最大吸收波长处测定吸光度值.

1.2.3 超声波辅助酶法提取玉米黄色素条件 按1.2.1提取，分别考察酶解温度55,60,65,70,75 ℃；乙醇浓度40%,50%,60%,70%,80%,90%；纤维素酶液浓度0.2%,0.4%,0.6%,0.8%,1.0%,1.2%,1.4%,1.6%；酶解时间1,2,3,4,5 h；提取液体积20,25,30,35,40 mL；超声温度45,50,55,60,65 ℃，以及超声时间5,10,15,20,25 min对玉米黄色素提取液吸光度值的影响.根据以上单因素结果设计正交试验，确定最佳提取条件.

2 结果与分析

2.1 超声波辅助酶法与超声波辅助提取玉米黄色素比较

由表1可知，超声波辅助酶法提取玉米黄色素提取效果较单纯超声波提取效果好，且超声波辅助纤维素酶比超声波辅助蛋白酶要好，提取量更大，以下测定结果为3次试验结果平均值，从而确定超声波辅助纤维素酶法进行以下实验.

表1 不同方法提取玉米黄色素的结果比较

2.2 超声波辅助酶法提取玉米黄色素的单因素试验结果与分析

2.2.1 酶解温度的确定 由表2可知，当温度小于65 ℃时，纤维素酶活性未达到最大，提取量随温度上升而逐渐增加；当温度高于65 ℃时，纤维素酶的活性逐渐下降，甚至丧失，玉米黄色素的提取量逐渐下降；当酶解温度为65 ℃时，纤维素酶活性最大，提取效果最好.

表2 酶解温度对玉米黄色素提取量的影响

2.2.2 乙醇浓度的确定 由表3可知，玉米黄色素的提取量乙醇浓度的增加而逐渐增加，在乙醇浓度为80%时，达到最大，后又有所降低，说明乙醇浓度为80%时，有利于纤维素酶发挥作用，或有利于玉米黄色素的溶解，提取效果最好.

表3 乙醇浓度对玉米黄色素提取量的影响

2.2.3 纤维素酶浓度的确定 由表4可知，随着酶浓度的增加，玉米黄色素的提取量逐渐增加，当增大到1.2%时，提取量变化缓慢，从节约试剂的角度考虑，选择1.2%纤维素酶浓度，既经济又能收到较好的提取效果.

表4 纤维素酶浓度对玉米黄色素提取量的影响

2.2.4 酶解时间的确定 由表5可知，玉米黄色素的提取量随酶解时间的增加先增加后减少，酶解时间为2 h和3 h时，提取量相当，但从成本和效率方面考虑，酶解2 h优于酶解3 h，故确定最佳酶解时间为2 h.

表5 酶解时间对玉米黄色素提取量的影响

2.2.5 料液比的确定 由表6可知，玉米黄色素的提取量随料液比的增加先增加后减少，在1∶6时，提取量达最大，故确定最佳料液比为1∶6.

表6 料液比对玉米黄色素提取量的影响

2.2.6 超声温度的确定 由表7可知，随着超声温度的增加，玉米黄色素提取量逐渐增加，当温度为60 ℃时，吸光度值达到最大，提取效果最好.

表7 超声温度对玉米黄色素提取量的影响

2.2.7 超声时间的确定 由表8可知，随着超声时间的延长，玉米黄色素的提取量先增加后减小，在15 min时吸光度值最大，提取效果最好.

表8 超声时间对玉米黄色素提取量的影响

2.3 超声波辅助酶法提取玉米黄色素的正交试验结果与分析

以玉米黄色素提取液吸光度值为参考指标，在上述单因素中料液比、超声温度、超声时间经单因素多次重复检验，无显著性差异，因此在以下正交试验表中不涉及这3个因素.设计正交试验L9(34)，试验因素水平及结果见表9.

表9 正交试验设计及数据处理

由表9可知，各因素对超声波辅助酶法提取玉米黄色素量影响的主次顺序为A(酶解温度)>C(酶解时间)>B(乙醇浓度)>D(纤维素酶浓度)，得出最佳的组合条件为A3B3C3D3，将试验3经验证试验得吸光度值为0.552，提取效果优于A3B3C3D3，因此确定最佳提取组合为A1B3C3D3，即酶解温度为60 ℃，酶解时间为2.5 h，乙醇浓度为85%，纤维素酶浓度为1.4%.

由表10知，酶解温度对提取量的影响达到了显著水平，而酶解时间、乙醇浓度和纤维素酶浓度对提取量影响不显著.

表10 方差分析表

3 结论

超声波和纤维素酶协同提取玉米黄色素时，纤维素酶的酶解作用较超声波对提取效果影响更大.超声波辅助酶法提取玉米黄色素的最佳条件为：酶解温度为60 ℃，酶解时间为2.5 h，乙醇浓度为85%，纤维素酶浓度1.4%.此时，玉米黄色素提取液的吸光度值达0.552，提取效果最好.