张 华，王 耕，王明华，华永永，樊一飞，王 蓓，袁 杰，李文仿，李 志

（1. 十堰市太和医院（湖北医药学院附属医院）普通外科，胚胎干细胞研究湖北省重点实验室，十堰 442000；2. 中南大学湘雅医学院附属海口医院普通外科，海口 570000；3. 锦州医科大学太和研究生培养基地， 十堰 442000）

神经介素U（neuromedin U，NMU）属于平滑肌收缩多肽，因可以引起子宫（uterus）平滑肌强烈收缩, 故以U命名［1］。NMU及其受体神经介素U受体1（neuromedin U receptor 1，NMUR1）广泛分布于人体的各个器官，参与调控新陈代谢、应激、摄食行为等多种生理功能，在多种癌症的发生发展中也具有重要的作用［2］。研究表明，在口腔癌［3］、食道癌［4］、头颈磷状上皮细胞癌［5］以及白血病［6］等恶性肿瘤中，NMU和NMUR1的甲基化对于肿瘤的发生发展有十分重要的作用。乳腺癌（breast invasive carcinoma，BRCA）是女性最常见的恶性肿瘤，也是癌症死亡的第二大原因，仅此于肺癌［7］。尽管乳腺癌的综合治疗已取得了很大的进展，但其侵袭性生长和易转移的特点仍是导致死亡的重要原因之一［8-10］。因此，研究与BRCA预后相关的基因对于评价患者的病情和生存具有重要意义。

DNA异常甲基化是癌症表观遗传学的一个基本特征。DNA甲基化相关功能元件（DNA methylation-related functional elements，DMFEs）的异常可导致肿瘤进展中调控基因的功能障碍，从而影响癌症患者的预后［11］。SurvivalMeth （http://bio-bigdata.hrbmu. edu.cn/survivalmeth）是由李霞教授等国内学者［12］开发的一个研究DMFEs对癌症预后影响的数据库，共收集了36种癌症包含13 371个样本中的81个DNA甲基化谱。用户可以用其在不同的数据集中研究他们感兴趣的基因，并且可以通过自动化分析与预后相关的DMFEs，包括甲基化水平、相关分析、临床分析、差异分析等，从而预测癌症的预后。本文采用SurvivalMeth在线数据库分析NMUR1在BRCA中的甲基化状态及其对预后的影响，旨在为NMUR1作为BRCA预后和（或）治疗的新靶点提供依据。

1 材料与方法

1.1 NMUR1在BRCA中的表达

使用UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）［13］的癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）分析模块分析NMUR1在BRCA肿瘤组织和正常乳腺组织中的表达情况。

1.2 NMUR1在BRCA中表达的验证

采用人类蛋白质图谱（the human protein atlas，HPA）数据库（https://www.protein atlas.org/）［14］中NMUR1在BRCA肿瘤组织和正常乳腺组织中表达的免疫组化结果验证NMUR1在BRCA中的表达情况。

1.3 NMUR1在BRCA中甲基化水平及预后相关分析

采用SurvivalMeth数据库［12］分析NMUR1在BRCA中的甲基化水平，同时进行比例风险（COX）回归分析、Kaplan-Meier生存分析以及胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤（CpG）岛甲基化风险模型分析。在单个基因分析界面，选择疾病类型为“Breast invasive carcinoma”，实验平台选择“450k”，输入基因名字“NMUR1”，其中转录相关元件、CpG相关元件、重复元素、CTCF绑定区域选择默认设置，即“Without Restriction”，差异分析的P值设置为0.01。采用t检验分析各个探针对应的肿瘤组织和正常乳腺组织中NMUR1甲基化水平的差异，采用COX回归模型分析NMUR1甲基化水平对患者的生存的影响，采用Kaplan-Meier生存分析研究NMUR1甲基化水平对BRCA患者预后的影响，使用自动化工具构建NMUR1甲基化模型并绘制甲基化模型风险曲线，并比较分析CpG岛甲基化高风险组和低风险组患者生存的差异。

2 结果与分析

2.1 NMUR1在BRCA和正常乳腺组织中的表达情况

将UALCAN数据库中来自TCGA的1 097例BRCA肿瘤组织样本、114例正常乳腺组织样本纳入分析，结果表明，NMUR1在BRCA肿瘤组织中的表达［0.148 3（0，0.690 4）］比在正常乳腺组织中的表达［1.779 3（0.077 2，8.825 1）］下调（P＜0.001）（图1）。

图1 NMUR1在BRCA和正常乳腺组织中的表达情况Fig. 1 Expression of NMUR1 in BRCA tissues of and normal tissues

2.2 HPA数据库中NMUR1在BRCA和正常乳腺组织中的免疫组化结果

HPA数据库中NMUR1在BRCA和正常乳腺组织中的表达结果显示，NMUR1在BRCA肿瘤组织中低表达（图2a），在正常乳腺组织中高表达（图2b）。

图2 NMUR1在BRCA组织与正常乳腺组织中蛋白表达的免疫组化染色Fig. 2 Immunohistochemical staining of NMUR1 protein expression in BRCA tissues of and normal tissues of patients（a）BRCA组织（HPA027895）；（b）正常乳腺组织（HPA027895）。(a) BRCA tissues (HPA027895); (b) Normal tissues (HPA027895).

2.3 NMUR1在BRCA中的甲基化状态

采用SurvivalMeth数据库分析NMUR1在BRCA中的甲基化情况，结果显示，有11个探针NMUR1甲基化水平有显著差异（P＜0.001）（图3），8个探针NMUR1甲基化水平无明显差异（P＞0.05）。由表1可知，NMUR1在BRCA中的甲基化可能存在11个位点，即cg00143376、cg01649597、cg02204630、cg10042319、cg16297948、cg17207690、cg18250832、cg18877969、cg19077400、cg21424120、cg26913833。

表1 NMUR1在BRCA中甲基化显著差异的结果Tab. 1 The significant result of differential analysis of NMUR1 methylation in BRCA

图3 NMUR1在BRCA组织与正常乳腺组织中甲基化水平Fig. 3 NMUR1 methylation level of different probes in BRCA and normal tissues

2.4 COX回归分析

COX风险回归模型分析发现，在11个甲基化位点中，cg17207690位点NMUR1甲基化对BRCA患者有降低死亡风险的作用［风险比（hazard ratio，HR） =0.001 900，95%CI（5.195e-06，6.940e-01），P=0.037］，其余10个位点NMUR1对BRCA预后无明显差异（P＞0.05）（表2）。

表2 NMUR1甲基化对BRCA患者预后影响的COX风险回归分析Tab. 2 COX regression model analysis of NMUR1 methylation on prognosis in BRCA patients

2.5 NMUR1在BRCA中甲基化Kaplan-Meier生存分析

构建NMUR1甲基化模型，按CpG岛甲基化风险分为高风险组（n=320）和低风险组（n=461），并绘制CpG岛甲基化模型风险曲线。Kaplan-Meier生存分析结果表明，NMUR1在乳腺癌中CpG岛甲基化与乳腺癌患者生存显著相关，甲基化高风险组患者生存率显著低于低风险组［HR=2.140 300, 95%CI （1.305 4, 3.509 1，P=0.001］（图4）。由NMUR1甲基化模型风险曲线可知，高风险组患者的预后较低风险组差（图5）。与低风险组相比，高风险组在cg18877969（P=0.015）、cg16297948（P=0.028）、cg19077400（P=0.011）、cg26913833（P=0.035）位点上的CpG岛甲基化水平较高，在cg00143376、cg01649597、cg02204630、cg10042319、cg17207690、cg18250832、cg21424120位点上，两组的CpG岛甲基化无明显差异（P＞0.05）（图6）。

图4 NMUR1在BRCA中甲基化CpG岛高风险组与低风险组的Kaplan-Meier生存曲线Fig. 4 The Kaplan-Meier survival curves of NMUR1 methylation at high and low levels of CpGs in BRCA

图5 NMUR1在BRCA中的甲基化模型风险曲线Fig. 5 Distribution of prognostic index of NMUR1 methylation level in BRCA

图6 NMUR1在BRCA中CpG岛甲基化高风险组与低风险组的甲基化水平Fig. 6 Heatmap of NMUR1 CpGs methylation level in BRCA

3 讨论

NMU于20世纪80年代首次在猪脊髓中发现，其及其受体广泛分布于动物体内，具有广泛的生理功能，并在生理过程中发挥重要的调节作用［1-2］。NMU在调节平滑肌收缩、内分泌系统、血压与心率、能量代谢、摄食行为、痛觉及癌症发生发展等方面具有十分重要的作用［15］。NMU主要通过与其特异性G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors，GPCRs），即NMUR1和神经介素U受体2 （NMUR2），结合来发挥作用［16］。NMUR1主要表达在胃肠道、泌尿生殖系统、脂肪组织、淋巴细胞、肾上腺皮质、心脏、胰腺、骨髓、脾、肺、气管、乳腺、外周血白细胞等外周器官、组织和细胞中，而NMUR2更高效地表达在中枢神经系统中，多数局限在大脑的特殊区域［17］。研究表明，NMUR1的甲基化对多种肿瘤的发生发展有十分重要的作用，包括口腔癌、食道癌、头颈磷状上皮细胞癌以及白血病等恶性肿瘤［18-19］。我们通过对UALCAN数据库中来自TCGA数据库的1 097例乳腺癌组织和114例正常乳腺组织中NMUR1的表达进行对比分析，发现NMUR1在乳腺癌组织中表达下调，同时对HPA数据库中NMUR1在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的免疫组化情况进行了进一步验证。

DNA的异常甲基化与多种肿瘤预后密切相关，研究基因甲基化也是研究肿瘤的诊断和预后，以及寻找治疗相关新靶点、新思路的重要方法［20-21］。目前对于NMUR1在BRCA中甲基化研究尚未见相关报道。本文通过SurvivalMeth数据库研究NMUR1在BRCA中的甲基化状态，发现NMUR1上有11个位点甲基化水平有显著差异；通过构建NMUR1甲基化模型，并绘制CpG岛甲基化模型风险曲线，研究NMUR1在BRCA中CpG岛甲基化水平与患者预后的相关性。Kaplan-Meier生存分析结果也发现NMUR1在BRCA中CpG岛甲基化与BRCA患者生存显著相关，且生存率与甲基化风险相关。与低风险组相比，高风险组在cg18877969、cg16297948、cg19077400、cg26913833位点上的CpG岛甲基化水平较高，在其他7个位点CpG岛甲基化无明显差异。经过分析，我们认为NMUR1在BRCA中的甲基化水平与BRCA患者的预后相关。

随着生物信息学的发展，越来越多学者通过生物信息分析方法研究BRCA的临床表型、分析机制、甲基化、肿瘤微环境等，为BRCA的预后以及治疗新靶点提供新的研究思路和方向［22-23］。国内外生物信息学者开发并建立了TCGA数据库、HPA数据库、UALCAN数据库等各种各样的生物学数据库，用于生物学样本的存储、下载和分析等。研究者可以通过这些数据库里庞大的数据进行生物信息学研究。基于生物信息学研究方法，本文首次采用SurvivalMeth数据库分析NMUR1在BRCA患者NMUR1甲基化状态及临床意义。

本文首次采用SurvivalMeth数据库分析NMUR1在BRCA患者中的甲基化状态及临床意义，通过多个数据库联合分析，增加了研究的可靠性，但仍需试验进一步验证，且NMUR1在BRCA中甲基化及对预后影响的机制也需要进行研究。