刘 杭，叶生宝，俞 杰，谭文芝，葛行义

（医学病毒学湖南省重点实验室，湖南大学生物学院，长沙 410082）

2019年12 月，严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）在中国武汉最先被发现鉴定。其导致的疾病被命名为新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19），症状包括发热、咳嗽、呼吸困难、肌痛和疲劳等。COVID-19在全球持续流行超过一年，对卫生和经济造成了巨大影响［1］。截至2021年7月12日，我国累计确诊病例共119 321例，累计死亡共5 588例，国外累计确诊病例共186 291 690例，日增长18万余例确诊病例，累计死亡病例达4 031 725例之多，对世界的经济、人类生活等造成了巨大的危害（WHO，https://covid19.who.int/）。新型冠状病毒主要通过唾液、飞沫、接触等传播，目前主要通过控制传染源、切断传播途径来进行有效防控。而长远来看，SARSCoV-2疫苗的普及使用是COVID-19防控的关键一环。但是由于新型冠状病毒的变异，某些突变株型能逃逸现有疫苗，因此需要设计研发更广谱且高效的SARS-CoV-2疫苗，而亚单位疫苗是其中一个重要候选［2］。

SARS-CoV-2属于冠状病毒科β-冠状病毒属，是一种有囊膜的单股正链RNA病毒，其基因组大约为30 kb，编码4种主要的结构蛋白，即刺突（spike，S）蛋白、包膜（envelope，E）蛋白、膜（membrane，M）蛋白和核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白［3］。核衣壳蛋白（nucleocapsid protein，NP）在病毒感染过程中高表达，且在成熟病毒粒子中含量高，同时具有很好的免疫原性［4］。病毒感染时，NP蛋白与病毒RNA一起进入宿主细胞，促进其复制，参与病毒粒子的组装和释放［5］。血清学诊断发现，严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）患者血清中针对NP蛋白的特异性抗体比严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）的其他结构蛋白具有更高的敏感性和更长的持久性［6-7］。冠状病毒的S蛋白负责病毒受体的识别与结合，协调病毒入侵，是重要的疫苗设计靶点，但是S基因变异高，如SARSCoV-2与SARS-CoV的S蛋白有76%的氨基酸相似性［8］。相比之下，N基因更保守稳定，且在长期流行过程中突变较少，如SARS-CoV-2与SARS-CoV的NP蛋白氨基酸同源性为90%［9］。因此，NP蛋白常用于血清学检验，也是疫苗设计的重要靶点。如Kumar等［10］对NP蛋白的平均抗原倾向进行分析，选择了SARS-CoV-2 NP蛋白设计多表位疫苗；Iwarson等［11］使用NP蛋白来防治感染，证明了乙型肝炎NP抗原免疫能保护黑猩猩免受乙型肝炎病毒的感染；黄亚渝等［12］证明了以胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸的寡脱氧核苷酸（cytosine-phosphate-guanine oligonucleotide，CpG-ODN）为佐剂的人黑色素瘤NP蛋白疫苗能诱发较强的特异性的细胞和体液免疫应答，可以减缓肿瘤的生长速度，延长荷瘤鼠的生存期，对荷瘤鼠有较好的抗肿瘤效果。因此，NP蛋白可以作为SARS-CoV-2的优质候选疫苗，其优势有序列保守、稳定、具有强大的免疫原性、在感染过程中不易发生突变等［13-14］。目前，关于SARS-CoV-2 NP蛋白的研究报道不多，对SARS-CoV-2 NP持续进行研究是有必要的。

FlaB（Flagellin B）是幽门螺旋杆菌鞭毛素基因编码的蛋白，可作为免疫佐剂增强抗原的免疫原性，也可作为基因工程疫苗的候选抗原［15］。此外，FlaB还可以增强肿瘤特异性CD8+T细胞免疫反应，抑制过敏反应，杀死肿瘤细胞［16-17］，具有很强的黏膜免疫佐剂活性，经鼻内给药后，可诱导小鼠产生保护性免疫［18］。有文献报道，用FlaB蛋白口服免疫剂可诱导机体产生体液免疫应答，产生高水平免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM），促进白细胞分化，加强其吞噬活性，提高机体的体液免疫应答［19］。目前其已应用到多种疫苗研究中。本研究对FlaB是否能增强SARS-CoV-2 NP蛋白的免疫原性，以及NP-FlaB融合蛋白是否能作为黏膜免疫亚单位疫苗诱导有效的黏膜免疫应答进行了研究，通过原核表达纯化NP、NP-FlaB融合蛋白，并将两组蛋白分别通过皮下注射和滴鼻免疫两种不同的免疫方式免疫BALB/c小鼠，对比两组蛋白免疫诱导的NP特异性血清抗体和黏膜抗体效价及特异性效应T细胞的应答水平，来分析FlaB对SARS-CoV-2 NP免疫原性的影响，并评估NP、NP-FlaB融合蛋白成为新型冠状病毒亚单位疫苗的潜力。

1 材料与方法

1.1 材料

SARS-CoV-2的N基因由生工生物工程公司合成，通过限制性内切酶EcoR I和XhoI双酶切将SARS-CoV-2（NCBI序列号：NC_045512.2）NP构建到pET28a（+）表达载体上。SARS-CoV-2的N基因经过原核密码子优化后，由生工生物工程公司合成，通过限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切将NP构建到pET32a（+）表达载体上。利用编码FlaB的质粒，通过限制性内切酶EcoR I和PstI双酶切将FlaB构建到pTYB12表达载体上。

1.2 方法

1.2.1 重组质粒载体的构建

以材料中提到的NP- pET32a（+）质粒为模板扩增同源重组NP片段，通过限制性内切酶SalI和EcoR I双酶切含FlaB序列的pTYB12质粒，并以同源重组法将片段重组至pTYB12质粒中，构建NPFlaB-pTYB12重组表达质粒，随后转化到表达菌株BL21（DE3）中，测序成功后待用。

1.2.2 目的蛋白的诱导表达及纯化

诱导表达NP蛋白。将过夜活化的表达菌株菌液以体积比1∶100的比例接种到液体溶菌肉汤（luria-bertani，LB）培养基中。当OD600nm值为0.8时，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropylbeta-D-thiogalactopyranoside，IPTG），使得终浓度为1.00 mmoI/L；37℃下200 r/min诱导12 h进行可溶性表达；10 000 r/min离心10 min后收集菌体，称重，按照每克菌体加4 mL非变性裂解液混合液（往4 mL非变性裂解液中加入40 μL溶菌酶和40 μL蛋白酶抑制剂），漩涡震荡混匀后在冰上放置30 min。设置超声破碎仪破碎功率为120 W，破碎2 s，暂停3 s，总破碎时长为45 min，对样品进行超声破碎。4℃下10 000 r/min离心30 min，收集上清，用碧云天Ni亲和层析柱纯化目的蛋白。磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline，PBS）过夜透析后，用超滤管进行浓缩，聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）法测蛋白浓度。蛋白可直接用于皮下免疫，分装后置于-80℃保存。

诱导表达NP-FlaB融合蛋白。当OD600nm值为0.8时，加入IPTG，使得终浓度为0.06 mmol/L；16℃下110 r/min诱导21 h进行可溶性表达；10 000 r/min离心5 min，收集菌体，后续同上。最后取上清过几丁质柱纯化NP-FlaB融合蛋白。

1.2.3 目的蛋白内毒素的去除和检测

用1%的聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）这种表面活性剂处理NP和NP-FlaB融合蛋白，在4℃冰箱中翻转30 min，随后置于37℃水浴锅中静置10 min，使之成为均相溶液；37℃下12 000 r/min离心10 min，取上层液体，重复3次，即可得到无内毒素的目的蛋白。用内毒素检测鲎试剂盒检测，检测合格后的蛋白用于滴鼻免疫试验。

1.2.4 疫苗的免疫

分别用NP、NP-FlaB融合蛋白对6～8周的BALB/c小鼠进行免疫，并分别使用皮下注射和滴鼻免疫两种方式进行免疫，每组6只，等摩尔质量给药。每次免疫前进行脸颊采血5～10滴，4℃下3 000 r/min 离心10 min后取上清，分装放置于-80℃保存待测。

1.2.5 酶联免疫吸附试验（ELISA）和酶免疫斑点试验（ELISPOT）

酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）：用包被液（coating buffer，CB）稀释NP蛋白至2 μg/mL，以每孔100 μL加入到酶标板孔中，4℃过夜包被；拍干，每孔加入200 μL含1% 牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）的PBS封闭液，于37℃封闭2 h后拍干；将收集的血清和黏膜样品分别用磷酸盐吐温缓冲液（phosphate tween bufferedsaline ，PBST）按梯度稀释（血清样品的稀释梯度为1∶300、1∶900、1∶2 700、1∶8 100、1∶24 300、1∶72 900、1∶218 700、1∶656 100，黏膜样品稀释梯度为1∶10、1∶30、1∶90、1∶270、1∶810、1∶2 430、1∶7 290、1∶21 870）后加入100 μL至酶标板孔中，作为试验组，并设置仅加入等体积PBST的孔作为阴性对照；常温孵育1 h后洗板3次［洗液为PBST（含0.05% 吐温20的PBS）］，拍干；用含1% BSA的PBST将辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗鼠二抗稀释5 000倍，每孔加入100 μL，常温孵育1 h，洗板4次并拍干；每孔加入100 μL 四甲基联苯胺（tetramethyl benzidin，TMB）显色液反应10 min；每孔加入50 μL的终止液，在酶标仪上测OD450nm，并记录数据，从中得到血清和黏膜样品中抗体滴度和抗体产生的趋势。

酶联免疫斑点试验（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）：取小鼠脾脏分离T淋巴细胞，细胞密度统一稀释至2.5×106个/mL；活化白细胞介素4（interleukin 4，IL-4）和伽马干扰素（interferon-gamma，IFN-γ）ELISPOT板之后，设置加入100 μL1640培养基稀释的刺激物（5 μg/mL NP蛋白）作为试验组，设置仅加入1640培养基的孔作为阴性对照，并设置加入佛波酯（phorbol-12-myristate-13-acetate+inomycin，PMA + Iono）的孔作为阳性对照；每孔加入100 μL稀释的各组细胞，37℃、5% CO2培养箱培养40～48 h；倾倒孔内细胞及培养基，每孔加入200 μL冰冷的灭菌超纯水，4℃冰箱放置10 min低渗裂解细胞［20］；洗板6次，扣干，将稀释好的生物素标记的抗体工作液加入各孔，每孔100 μL，37℃ 孵育1 h；洗板6次，将稀释好的酶标亲和素工作液加入各孔，每孔100 μL，37℃孵育1 h；洗板5次，扣干，揭开板底座，用灭菌水洗涤膜底面及底座，吸干底座及膜底残留的水迹，合上底座，洗板1次，彻底扣干孔内液体；将现配的3-氨基-9-乙基咔唑（3-amino-9-eyhylcarbazole，AEC）显色液加入各试验孔中，每孔100 μL，室温避光静置10 min；倾倒孔内液体，揭开板底座，用灭菌水洗涤正反面及底座3～5遍，终止显色；自然晾干后拍照计数，记录斑点的各种参数做统计分析。

1.3 数据统计与分析

免疫血清和黏膜样品的抗体效价是由试验组测得的吸光度值（用P表示）与阴性对照组的吸光度值（用N表示）的比值计算得到的数值，P＞2.1N时的稀释倍数计为样品的抗体效价。对照组和试验组同一批次进行试验，避免批次间的误差，且应至少重复2次，以保证数据的准确性。所有试验数据均重复2次以上，取平均值。不同组间的统计学差异以t-test进行检验，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 NP蛋白在感染康复患者中的分布

本试验用ELISA检测法对感染康复患者血清混合样本进行了针对NP蛋白的特异性抗体检测，在混合血清中检测到了针对NP蛋白的免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）抗体（图1），证明了NP蛋白在人体感染SARS-CoV-2时引起的免疫反应中扮演着重要的角色。这一结果与Zeng等［14］、Guo等［21］在确诊的COVID-19患者不同稀释倍数的血清中检测到针对NP蛋白的IgG、免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）和IgM抗体的结果一致，且这一现象在康复期患者的血清中也被证实存在。Tan等［6］、Shi等［7］在血清学诊断中发现，SARS患者血清中针对NP蛋白的特异性抗体比SARS-CoV的其他结构蛋白具有更高的敏感性和更长的持久性。这一结果证实了NP蛋白抗体在机体对抗SARS-CoV-2感染的免疫应答，以及其在新冠灭活疫苗的免疫应答中发挥着重要作用。因此，开发NP作为SARSCoV-2亚单位疫苗具有重要的意义。

图1 采用ELISA法检测不同稀释度感染康复患者血清和正常人血清中SARS-CoV-2 NP的特异性IgGFig. 1 Using ELISA assay to detect the SARS-CoV-2 NP-specific IgG in different dilutions of infected convalescent patient serum and normal human serum

2.2 NP、NP-FlaB蛋白的纯度分析

NP、NP-FlaB蛋白分别以Ni亲和层析柱和几丁质亲和层析柱纯化，得到纯度较高的目的蛋白。SDS-PAGE分析和Western blot分析结果显示，NP、NP-FlaB的分子量大小分别为48 kD和92 kD。SDSPAGE图像的灰度分析结果显示，NP、NP-FlaB蛋白的纯度分别为83.9%、81.5%（图2）。

图2 NP、NP-FlaB蛋白的纯化及灰度分析Fig. 2 Purification and gray scale analysis of NP and NP-FlaB proteins （a）SDS-PAGE检测纯化的NP蛋白；（b）灰度分析纯化的NP蛋白（1为NP蛋白峰；2～5为杂蛋白峰）；（c）Western blot检测纯化的NP蛋白；（d）SDS-PAGE检测纯化的NP-FlaB蛋白；（e）灰度分析纯化的NP-FlaB蛋白（1为NP-FlaB蛋白峰；2～4为杂蛋白峰）；（f）Western blot检测纯化的NP蛋白。(a) The purified NP protein was detected by SDS-PAGE; (b) The NP protein was purified by gray scale analysis (peak 1 is NP protein peak；2～5 for miscellaneous protein peak); (c) The purified NP protein was detected by Western blot; (d) The purified NP-FlaB protein was detected by SDS-PAGE; (e) The NP-FlaB protein was purified by gray scale analysis (peak 1 is NP-FlaB protein peak；2～4 for miscellaneous protein peak); (f) The purified NP protein was detected by Western blot.

2.3 NP疫苗滴鼻免疫的免疫效果分析

如图3所示，滴鼻免疫NP-FlaB疫苗的小鼠获得了较高滴度的特异性IgG抗体，且抗体滴度显著高于NP组。NP组第二、三次免疫后血清稀释倍数分别为50、600时，其与对照组OD450nm比值仍然大于2∶1；NP-FlaB组第二、三、四次免疫后血清稀释倍数平均值分别为1 050、2 900、17 100时，其与对照组OD450nm比值仍然大于2∶1。滴鼻免疫组小鼠的黏膜样品中，除了NP-FlaB组肺灌洗液（lung washing fluid，LW）IgA抗体滴度明显高于NP组外（图4c），唾液、鼻腔灌洗液（nasal washing fluid，NW）、阴道灌洗液（vaginal washing fluid，VW）和肺组织中的IgA抗体效价较低，与对照组基本无差别（图4a、4b、4d、4e）。结果显示，NP-FlaB滴鼻组小鼠血清和肺灌洗液中抗体效价明显高于NP滴鼻组，表明融合FlaB增强了NP蛋白的黏膜免疫应答效果。

图3 NP-FlaB滴鼻免疫BALB/c小鼠诱导SARS-CoV-2 NP特异性抗体水平的评测Fig. 3 Evaluation of SARS-CoV-2 NP-specific antibodies induced by intranasal immunized with NP, NP-FlaB in BALB/c mice（a）滴鼻免疫流程；（b）免疫56天不同稀释度血清SARS-CoV-2 NP特异性IgG的检测；（c）免疫70天不同稀释度血清SARS-CoV-2 NP特异性IgG的检测；（d）免疫80天不同稀释度血清SARS-CoV-2 NP特异性IgG的检测；（e）免疫56天血清NP特异性IgG抗体效价；（f）免疫70天血清NP特异性IgG抗体效价；（g）免疫80天血清NP特异性IgG抗体效价。●表示NP组；■表示NP-FlaB组；▲表示无热源水对照组。 **：P＜0.01；ns：P＞0.05。(a) Protocal of intranasal immunization; (b) Detection of the SARS-CoV-2 NP-specific IgG in different dilutions of serum from day 56; (c) Detection of the SARS-CoV-2 NP-specific IgG in different dilutions of serum from day 70; (d) Detection of the SARS-CoV-2 NP-specific IgG in different dilutions of serum from day 80; (e) NP-Specific IgG titer in serum from day 56; (f) NP-Specific IgG titer in serum from day 70; (g) NP-Specific IgG titer in serum from day 80. ● stands for group NP; ■ stands for group NP-FlaB; ▲ stands for group non-thermal water. **: P＜0.01; ns: P＞0.05.

图4 NP、NP-FlaB滴鼻免疫小鼠的黏膜样品中SARS-CoV-2 NP特异性IgA抗体的检测Fig. 4 Detection of NP-specific IgA antibodies against SARS-CoV-2 in the mucosa samples of intranasal immunization BALB /c mice by NP, NP-FlaB vaccine （a）滴鼻免疫唾液；（b）滴鼻免疫鼻腔灌洗液；（c）滴鼻免疫肺灌洗液；（d）滴鼻免疫阴道灌洗液；（e）滴鼻免疫肺组织。●表示NP组；■表示NP-FlaB组；▲表示无热源水对照组。(a) Saliva of intranasal immunization; (b) Nasal washing fluid of intranasal immunization; (c) Lung washing fluid of intranasal immunization; (d) Vaginal washing fluid of intranasal immunization; (e) Lung tissue of intranasal immunization. ● stands for group NP; ■ stands for group NPFlaB; ▲stands for group non-thermal water.

2.4 NP疫苗皮下注射的免疫效果分析

如图5所示，皮下注射NP、NP-FlaB的小鼠血清中抗体滴度很高。NP组第一、二、三次免疫后血清稀释倍数分别为18 000、437 400、656 100时，其与对照组OD450nm比值仍然大于2∶1；NP-FlaB组第一、二、三次免疫后血清稀释倍数分别为3 300、291 600、510 300时与对照组OD450nm比值仍然大于2∶1。由此可以得出，两组试验组小鼠血清中抗体效价基本一致，NP-FlaB皮下注射的免疫方式对NP的免疫原性没有增强作用或增强效果不明显。但值得注意的是，两组免疫血清中都获得了高滴度NP特异性的IgG抗体。

图5 NP、NP-FlaB皮下免疫BALB/c小鼠诱导产生SARS-CoV-2 NP特异性抗体Fig. 5 Inducing the production of SARS-CoV-2 NP-specific antibodies in BALB/c mice subcutaneous immunized with NP, NP-FlaB （a）皮下免疫流程；（b）免疫14天不同稀释度血清SARS-CoV-2 NP特异性IgG的检测；（c）免疫28天不同稀释度血清SARS-CoV-2 NP特异性IgG的检测；（d）免疫35天不同稀释度血清SARS-CoV-2 NP特异性IgG的检测；（e）免疫14天血清NP特异性IgG抗体效价；（f）免疫28天血清NP特异性IgG抗体效价；（g）免疫35天血清NP特异性IgG抗体效价。●表示NP组；■表示NP-FlaB组；▲表示PBS组。 ***：P＜0.001；ns：P＞0.05。(a) Protocal of subcutaneous immunization; (b) Detection of the SARS-CoV-2 NP-specific IgG in different dilutions of serum from day 14; (c) Detection of the SARS-CoV-2 NP-specific IgG in different dilutions of serum from day 28; (d) Detection of the SARS-CoV-2 NP-specific IgG in different dilutions of serum from day 14; (e) NP-specific IgG titer in serum from day 14; (f) NP-specific IgG titer in serum from day 28; (g) NPspecific IgG titer in serum from day 35. ● stands for group NP; ■ stands for group NP-FlaB; ▲ stands for group PBS. ***: P＜0.001; ns: P＞0.05.

ELISPOT的每个斑点代表一个分泌抗体或细胞因子的细胞［22］。如图6所示，皮下注射组NP、NP-FlaB的NP刺激试验组斑点数量无显著差异，但IL-4组斑点数比IFN-γ组斑点数多近百倍。这证明皮下注射NP、NP-FlaB疫苗都诱导出了分泌细胞因子IL-4的NP特异性的效应T细胞，从而调控免疫应答。

图6 ELISPOT法检测特异性T细胞应答Fig. 6 Specific T-cell responsee measured by ELISPOT（a）分泌IFN-γ的特异性T细胞数量；（b）分泌IL-4的特异性T细胞数量；（c）分泌IFN-γ的特异性T细胞斑点图；（d）分泌IL-4的特异性 T细胞斑点图。*：P＜0.05；***：P＜0.001。(a) The number of specific T cells with secretion of IFN-γ; (b) The number of specific T cells with secretion of IL-4; (c) Spot of specific T cells secreting IFN-γ; (d) Spot of specific T cells secreting IL-4. *: P＜0.05; ***: P＜0.001.

3 讨论

本文通过不同免疫方式免疫小鼠，采用ELISA方法对其血清、黏膜样品进行抗体滴度的检测，用ELISPOT分析评价免疫效果，探究其可能的作用路径。NP-FlaB组免疫血清的NP特异性IgG抗体效价和肺灌洗液中NP特异性IgA抗体效价明显高于NP组和对照组。皮下注射两组蛋白后都诱导出了高滴度的抗体，刺激产生一定数量的分泌IL-4的特异性效应T细胞，产生的抗体效价和特异性效应T细胞数量无显著差别。皮下免疫NP、NP-FlaB都能产生高滴度的抗体，使得机体获得体液免疫，调控免疫应答。NP有可能是通过刺激淋巴细胞分泌IL-4这种细胞因子，促进II型辅助T细胞（T helper cells 2，Th2）细胞增殖，抑制I型辅助T细胞（T helper cells 1，Th1）细胞增殖，同时辅助B细胞活化，发挥机体体液免疫作用，从而调控免疫应答。是否是通过此方式激活体液免疫还需要进一步验证。以上结果表明，FlaB可以作为黏膜佐剂增强SARSCoV-2 NP的免疫原性。总而言之，皮下注射50 μg NP、NP-FlaB，免疫3次，可以得到高滴度的NP特异性IgG抗体，使机体获得免疫。NP、NP-FlaB的免疫应答主要是通过诱导体液免疫来实现的，可以作为SARS-CoV-2的疫苗候选，其具体机制有待进一步深入研究。

SARS-CoV-2引发的COVID-19成为全球大流行疾病，且这种感染比季节性流感等其他疾病更容易传播，在世界范围内广泛地人传人。由于目前尚无针对SARS-CoV-2的特效药物，疫苗的研发和应用对疾病防控显得尤为关键。有研究报道，CoV NP蛋白能诱导保护性的特异性细胞毒性T淋巴细胞，且中和抗体滴度与NP蛋白特异性T细胞数量显著相关［23-25］，这与本文研究结果一致。此外，S蛋白作为SARS-CoV-2中最常见的候选蛋白，其突变速度要远高于NP蛋白。NP蛋白的保守性、免疫原性及其随时间的突变率低等特点，都使得其在新冠肺炎全球大流行背景下极大可能成为通用性的保护性疫苗，具有成为SARS-CoV-2候选疫苗的巨大潜力。

FlaB作为黏膜佐剂已应用到多种疫苗研究中，如诺如病毒二聚体疫苗可通过黏膜佐剂FlaB增强特异性保护性免疫应答［26］；鼻内给药的FlaB佐剂灭活流感疫苗能增强黏膜免疫应答，以保护小鼠免受致命感染［27］；融合FlaB的重组肺炎球菌表面蛋白A（pneumococci surface protein A，PspA）的鼻内免疫能增强小鼠对肺炎链球菌感染的交叉保护免疫［28］。以上结果与本文研究结果一致，FlaB能作为黏膜佐剂增强目的蛋白的免疫原性。pcD-FlaB疫苗肌肉注射豚鼠后，其在豚鼠体内不但具有抗同型钩体感染的作用，也具有较好的交叉保护作用［29］。但在我们的研究中，用皮下注射的方式注射FlaB对SARS-CoV-2 NP蛋白的免疫增强作用不明显，但也能诱导出高滴度的抗体。这暗示着，免疫方式对FlaB能否起到免疫增强剂的作用是至关重要的，用滴鼻或者口服等方式才能更好地发挥FlaB的佐剂活性。本文为SARS-CoV-2 NP蛋白免疫原性及其成为潜在的亚单位疫苗提供了理论依据，有助于后续基于NP疫苗的设计和研发。