郭志华，王 聪，陈红玲

（1 宿州学院生物与食品工程学院 安徽宿州 234000 2 宿州学院化学与化工学院 安徽宿州 234000）

红茶菌饮料是以红茶水为原料，经微生物发酵而成的一种功能性饮料[1]。红茶菌中的微生物主要包括醋酸菌、酵母菌和乳酸菌[2]。红茶菌发酵液中含有茶叶的浸出物，活的微生物及其代谢产物，具有抗氧化、抗癌，提高免疫力等保健功能。

乳酸菌是革兰氏阳性菌，可发酵碳水化合物生成乳酸等有机酸，广泛存在于动物肠道、植物表面、发酵乳制品、泡菜、青贮饲料等环境中[3]。乳酸菌不仅有利于食品发酵，而且能够提高食品的营养价值，对人体的生理功能起到较好的调节作用[4]。

为充分了解红茶菌中乳酸菌的功能特性，从红茶菌中分离纯化具有降解亚硝酸盐能力的优良乳酸菌，通过形态观察、生化性质测定和16S rDNA 菌株鉴定，研究其发酵性能、耐胃肠道性和黏附性能等功能，并评价红茶菌中乳酸菌的安全性，为更好地开发红茶菌提供安全优质的乳酸菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

MC 培养基、氨基酸脱羧酶对照培养基和血琼脂平板，广东环凯公司；MRS 肉汤培养基，杭州百思公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒，北京天根公司；16S 上、下游引物，上海生工；抗菌药敏纸片，杭州微生物公司；HiBio 生化鉴定试剂盒，Hi-Media 公司。其余均为国产分析纯或化学纯试剂。

1.2 仪器与设备

722 型紫外-可见分光光度计，上海仪电；My-Cycler PCR 扩增仪，美国Bio-Rad；SW-CJ-1D 超净工作台，上海沪净；电热恒温培养箱，上海尚仪。

1.3 方法

1.3.1 降解亚硝酸盐乳酸菌的筛选 蘸取红茶菌汁在MC 平板上划线，37 ℃培养48 h，用灭菌牙签挑取有明显溶钙圈的单菌落接入MRS 液体培养基中培养。接触酶反应阴性，革兰氏染色镜检阳性的菌株初步鉴定为乳酸菌。

将初步鉴定为乳酸菌的菌株活化，按体积分数5%接种于含有125 mg/L NaNO2的MRS 液体培养基，37 ℃培养48 h，菌液离心后取上清液2 mL，加入2 mL 对氨基苯磺酸溶液，避光静置5 min，再加入1 mL 盐酸萘乙二胺溶液，避光静置15 min，观察各菌株培养液的颜色变化，选出颜色较浅的菌株[5]。

1.3.2 筛选乳酸菌的鉴定

1.3.2.1 形态特征观察 筛选出的菌株在MRS 平板划线，观察单菌落颜色、大小、质地、边缘等培养特征；革兰氏染色镜检菌体颜色、菌体性状和排列方式。

1.3.2.2 生化鉴定 采用HiBio 生化鉴定试剂盒，进行七叶苷水解试验、接触酶试验、木糖发酵试验、纤维二糖发酵试验、麦芽糖发酵试验、半乳糖发酵试验、甘露糖发酵试验、蜜二糖发酵试验、棉子糖发酵试验、蔗糖发酵试验、海藻糖发酵试验、阿伯拉糖发酵试验等生化试验，根据颜色变化判断试验是阳性还是阴性。

1.3.2.3 16S rDNA 的扩增和序列分析 提取乳酸菌基因组，用细菌通用引物27f 和1492r 扩增细菌的16S rDNA 的保守序列，PCR 产物测序后与Genbank 数据进行BLAST 核酸数据比对[6]。

1.3.3 筛选乳酸菌功能特性研究

1.3.3.1 发酵特性研究

1）降解亚硝酸盐能力测定 乳酸菌按体积分数5%接种于含有125 mg/L NaNO2的MRS 液体培养基，37 ℃培养，每隔3 h 测定培养液中NaNO2含量，计算培养液中亚硝酸盐降解率。

NO2-降解率（%）=（初始NO2-含量-培养后NO2-含量）/初始NO2-含量%

亚硝酸盐含量的测定采用GB/T 5009.33-2010《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》中盐酸萘乙二胺分光光度法[7]。

2）产酸能力测定 按体积分数5%接种于MRS 液体培养基，每3 h 测培养液的pH 值和滴定酸度。

总酸的测定按GB/T 12456-2008 《食品中总酸的测定》进行，总酸含量以乳酸计[8]。

1.3.3.2 耐胃肠道研究 将含有125 mmol/L Na-Cl、7 mmol/L KCl、45 mmol/L NaHCO3的溶液灭菌，溶解胃蛋白酶，过滤除菌，胃蛋白酶终质量浓度为3 g/L，调pH 值到2.5，制得人工胃液[9]。

将含有45 mmol/L NaCl 和3 g/L 的牛胆盐溶液灭菌，溶解胰蛋白酶，过滤除菌，胰蛋白酶终质量浓度为1 g/L，调pH 值到8.0，制得人工肠液[9]。

将乳酸菌按5%接种量接入MRS 液体培养基中，37 ℃培养24 h。低温离心收集菌体，将菌体分别重悬人工胃液和人工肠液3 h 和6 h，收集菌液，根据GB 47892-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》进行活菌计数，耐受性以存活率计算，公式如下：

存活率（%）=lgN1/lgN0×100

式中，N1——经耐受处理后的活菌数（CFU/mL）；N0——耐受处理前的活菌数（CFU/mL）。

1.3.3.3 黏附性能测定

1）表面疏水性测定[10]将乳酸菌活化后接种到MRS 液体培养基中，37 ℃培养24 h，低温离心收集菌体，用无菌PBS（pH 7.0）洗涤菌体两次，重悬于0.1 mol/L KNO3溶液中，在波长600 nm 处调吸光度值为0.6，记为A0。将1 mL 二甲苯、氯仿和乙酸乙酯分别加入3 mL 菌液中，混匀后放置10 min 再混匀，放置20 min，在波长600 nm 处测上层吸光度值，记为At。

通过公式计算乳酸菌黏附有机溶剂的百分比，即乳酸菌的疏水率。

疏水率（%）=（1-At/A0）×100

2）自凝聚测定[11]将乳酸菌37 ℃培养过夜，低温离心收集菌体，用无菌PBS（pH 7.0）洗涤菌体两次，重悬无菌PBS 中，在波长600 nm 处调吸光度值为0.6，记为Ao。取3 mL 菌液振荡混匀10 s，37 ℃静置1，2，3 h 和4 h，取1 mL 上清液，在600 nm 处测吸光度值，记为At。

自动聚集率/%=（1-At/Ao）×100

3）黏附率的测定[12]将乳酸菌37 ℃培养过夜，低温离心收集菌体，用无菌PBS（pH 7.0）洗涤菌体两次，重悬DMEM 培养液中，将Caco-2 细胞置CO2培养箱中37 ℃培养至单层细胞，用胰酶-EDTA 消化液消化后重悬DMEM 培养液中。制备好的细胞悬液置于24 孔培养板中培养至单层细胞。将100 μL 乳酸菌悬液和900 μL DMEM 培养液加入细胞培养孔中，置CO2培养箱中37 ℃培养90 min，用无菌PBS 洗涤细胞两次，除去未黏附的菌体。再加入1 mL Triton100（体积分数为1%），使Caco-2 与黏附菌体分开，培养液根据GB 47892-2010 进行活菌计数，通过公式计算乳酸菌对Caco-2 细胞的黏附率。

黏附率（%）=黏附菌数/每孔中添加菌数×100

1.3.3.4 安全性评价

1）耐药性检测 采用药敏纸片琼脂扩散法将菌液培养至105～106CFU/mL，涂布在MRS 琼脂平板上，将无菌水纸片、青霉素G 纸片、阿莫西林纸片、四环素纸片、万古霉素纸片、氯霉素纸片和红霉素纸片贴于MRS 琼脂平板上，37 ℃培养48 h，观察并测量抑菌圈直径大小[13]。

2）有害代谢物评价 氨基脱羧酶试验：在灭菌后的氨基酸脱羧酶培养基中分别加入质量分数为0.1%的酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸和精氨酸和质量分数为0.005%的5-磷酸吡哆醛，乳酸菌按体积分数5%接入上述液体培养基中，每24 h转接1 次，转接6～8 次后，按10%的量分别接入对应的氨基脱羧酶培养基中，37 ℃培养3～4 d 后观察试验管（加入氨基酸接入乳酸菌）与空白管（不加氨基酸接入乳酸菌）的颜色变化。空白管为黄色，若试验管为黄色，则结果为阴性；若试验管为紫色，则结果为阳性[14]。

硝酸盐还原酶检测试验：乳酸菌活化后，按体积分数5%接入硝酸盐培养基中，37 ℃培养3 d，滴加KI 溶液和淀粉溶液，同时做空白试验。培养液变蓝色为阳性，不变色为阴性[15]。

溶血试验：挑取活化后的乳酸菌在血琼脂平板上划线，37 ℃培养48 h，观察有无溶血圈，同时用金黄色葡萄球菌作为阳性对照比较[15]。

吲哚试验：把乳酸菌按体积分数5%接入蛋白胨水培养基中，37 ℃培养48 h 后加入2 mL 乙醚，充分震荡，待乙醚浮在上层液面，沿管壁加入吲哚试剂，观察两层交界处颜色变化[11]。

所有试验均做3 次平行试验，试验数据采用Origin 8.5 进行数据统计分析，对各组数据进行单因素方差分析，P＜0.05 表示数据间存在显著性差异。

2 结果与分析

2.1 优良乳酸菌的筛选

MC 培养基中含有CaCO3，乳酸菌发酵糖产酸使菌落周围CaCO3溶解产生溶钙圈，产酸越强，溶钙圈越大。从红茶菌中共分离出有明显溶钙圈的菌株42 株。红茶菌中含有较多产酸的醋杆菌和酵母菌，镜检革兰氏阳性同时接触酶阴性的有27株，初步鉴定为乳酸菌，编号为HCR-1、HCR-2、HCR-3……。

分离的乳酸菌，按体积分数5%接入含有NaNO2的MRS 液体培养基中，37 ℃培养36 h，NaNO2与对氨基苯磺酸生成重氮盐，重氮盐再与盐酸萘乙二胺进行偶合反应生成紫红色的偶氮化合物[5]。MRS 液体培养基中的NaNO2经乳酸菌降解，降解能力越强，NaNO2含量越低，颜色越浅。不同乳酸菌降解NaNO2能力不同，其中HCR-8、HCR-20 和HCR-24 显色较浅。

2.2 乳酸菌的鉴定

2.2.1 形态特征观察 筛选3 株菌在MRS 固体培养基上的菌落较小，呈白色，圆形，表面光滑湿润。3 株乳酸菌的镜检如图1所示，HCR-8 和HCR-24 革兰氏染色阳性，菌体均为杆状，链状排列；HCR-20 革兰氏染色阳性，菌体短杆状，成对或链状排列。

图1 3 株乳酸菌的镜检图Fig.1 Microscopic examination of three strains of lactic acid bacteria

2.2.2 生化鉴定 采用HiBio 生化鉴定试剂盒检测HCR-8、HCR-20、HCR-24 对碳源的利用能力，结果七叶苷水解试验、纤维二糖发酵试验、麦芽糖发酵试验、甘露糖发酵试验、蜜二糖发酵试验、蔗糖发酵试验和海藻糖发酵试验均为阳性；木糖发酵试验、阿拉伯糖发酵试验、半乳糖发酵试验和棉籽糖发酵试验均为阴性。

2.2.3 16 S rDNA 的扩增和序列分析 以乳酸菌的DNA 为模板，PCR 扩增得到约1.5 kb 片段（图2）。将16S rDNA 的测序结果提交NCBI 进行BLAST 比对分析，结果发现HCR-8 和HCR-24 与植物乳杆菌同源性为97%，HCR-20 与干酪乳杆菌同源性为98%。

图2 3 株乳酸菌16S rDNA 序列扩增电泳图Fig.2 Electrophoresis pattern of 16S rDNA sequence amplification of three strains of lactic acid bacteria

根据乳酸菌菌落特征、菌体形态特征、糖发酵试验和16S rDNA 的序列分析，HCR-8 和HCR-24 鉴定为植物乳杆菌，HCR-20 鉴定为干酪乳杆菌[16]。

2.3 乳酸菌功能特性

2.3.1 发酵特性

2.3.1.1 产酸能力 从图3可看出HCR-8、HCR-20 和HCR-24 在6～15 h 间pH 值和总酸度含量变化幅度较大，组内差异显著（P＜0.05），乳酸菌处于生长对数期，菌体数量不断增加，产酸量不断升高。15 h 后产酸量趋于平缓（P＞0.05），可能是菌体生长进入平稳期。其中HCR-20 产酸能力较强，发酵至21 h，pH 值降至3，27 h 时 pH 值降至2.7；HCR-8 其次，发酵至24 h，pH 值降至3；HCR-24发酵至27 h，pH 值降至3.4。乳酸菌在厌氧环境下，利用碳水化合物产生乳酸等有机酸[17]，与乳酸菌的抑菌性、降低亚硝酸盐能力等有关[18]。

图3 3 株乳酸菌生长过程中pH 值和酸度的变化Fig.3 Changes of pH value and acidity of three strains of lactic acid bacteria in growth

2.3.1.2 降解亚硝酸盐能力 由图4可看出，3 株乳酸菌随着培养时间的延长，菌株降解亚硝酸盐能力增强。在6～15 h 间，亚硝酸盐降解率上升幅度较大，组内差异显著（P＜0.05），第15 小时亚硝酸盐降解率是第6 小时的7～8 倍，这与产酸特性一致。6～15 h 乳酸菌处于对数生长期，菌体数量增幅较大。3 株乳酸菌发酵至24 h，亚硝酸盐降解率均在90%左右；发酵至27 h，亚硝酸盐降解率大于或等于93%，其中HCR-20 亚硝酸盐降解率达99%。乳酸菌降解亚硝酸盐与pH 值呈显著负相关，与总酸度呈正相关[18]，当pH 值小于4.0 时，亚硝酸盐的降解主要是酸降解。

图4 3 株乳酸菌发酵过程中亚硝酸盐降解率的变化Fig.4 Changes of nitrite degradation rate of three strains of lactic acid bacteria in growth

2.3.2 耐胃、肠道环境研究 人们在饮用红茶菌时，一般无需加热直接饮用，乳酸菌进入人体后，只有活菌顺利通过胃抵达小肠，才能对宿主起到益生作用[19]，这就要求乳酸菌能够耐受胃、肠道的环境。流体食物在胃内停留时间约2～3 h，人体胃液pH 值通常在3.0 左右，食物经胃液消化后进入小肠，在小肠停留时间约2～6 h，因此本研究选择人工胃液的pH 3.0，消化时间3 h；人工肠液的pH 8.0，消化时间6 h[20]。HCR-8、HCR-20、HCR-24 对人工胃、肠液的耐受性见表1。3 株菌在人工胃液消化3 h 后，存活率分别为 （46.00±0.16）%，（62.00±0.20）%和（39.00±0.11）%，3 株菌有显著性差异（P＜0.05），其中HCR-20 的存活率大于60%。3 株菌在人工肠液消化6 h 后存活率均大于50%，3 株菌没有显著性差异（P＞0.05）。

表1 3 株乳酸菌耐胃肠道环境研究Table 1 Three strains of lactic acid bacteria resistant to gastrointestinal tract

2.3.3 黏附性能 乳酸菌进入人体后，不仅要耐受胃、肠道环境，还要具有良好的肠道黏附性能，才能最终定殖在肠道发挥其益生特性[21]。本文研究了HCR-8、HCR-20、HCR-24 的表面疏水性、自凝聚性和体外Caco-2 细胞黏附性。

2.3.3.1 表面疏水性 微生物细胞表面疏水性是微生物细胞重要的理化性质之一，主要影响细菌非特异性吸附到生物表面[22]。菌体的表面疏水性能反映其黏附性，疏水性越强，对肠上皮细胞的黏附作用越强[23]。3 株乳酸菌的疏水性见图5。3 株乳酸菌对氯仿的疏水性均高于乙酸乙酯，尤其是HCR-20 对氯仿的疏水性大于80%，组间显著性差异（P＜0.05）。氯仿是酸性溶剂，属电子受体，而乙酸乙酯是单碱性溶剂，属电子供体[21]，这3 株乳酸菌都是电子供体。二甲苯是一种非极性溶剂，除菌株HCR-24 外，HCR-8 和HCR-20 对二甲苯的疏水性均大于50%，说明这两株菌都有疏水的细胞表面。

图5 3 株乳酸菌在3 种有机溶剂中的表面疏水性Fig.5 Surface hydrophobicity of three strains of lactic acid bacteria in three organic solvents

2.3.3.2 自凝聚 3 株乳酸菌分别在2，4，6 h 的自凝聚率测定结果如图6所示。2 h 时，3 株菌的自凝聚率分别为32%，36%和19%，其中HCR-8和HCR-20 显著高于HCR-24（P＜0.05）。随着时间的延长，所有菌株凝聚率逐渐增大，HCR-8 和HCR-20 自凝聚率增速显著高于HCR-24 （P＜0.05）。HCR8 和HCR-20 在起始涡旋震荡后沉降较快，4 h 后菌悬液的上层溶液澄清，而HCR-24在6 h 试验结束时上层溶液较浑浊。结合疏水性试验结果，菌株的自聚集性与表面疏水性相一致，即表面疏水性强的菌株也具有较强的自聚集性，这与文献报道一致[21]。

图6 3 株乳酸菌自凝聚性Fig.6 Three strains of lactic acid bacteria self-cohesive

2.3.3.3 黏附率测定 乳酸菌要发挥益生作用，首先要黏附到肠上皮细胞，通过体内试验评价乳酸菌的黏附性能较困难，可以用体外模拟，Caco-2细胞为人体结肠腺癌细胞，无论是形态还是功能都与动物小肠上皮细胞非常接近[23]，被广泛用作体外细胞模型来评价乳酸菌的黏附性能。筛选的3 株乳酸菌与Caco-2 细胞共培养90 min 后，除去未黏附的菌体，黏附的乳酸菌根据食品安全国家标准食品微生物学检验（GB 4789-2010）进行活菌计数，乳酸菌对Caco-2 细胞的黏附率见图7。3株乳酸菌的黏附率存在较明显的菌株差异性（P＜0.05），其中HCR-20 的黏附率最高17%，HCR-8和HCR-24 的黏附率分别为14%和9%。

图7 3 株乳酸菌对Caco-2 细胞的黏附率Fig.7 Adhesion rate of three strains of lactic acid bacteria to Caco-2 cells

2.3.4 安全性评价结果

2.3.4.1 耐药性 随着抗生素的广泛应用，微生物的耐药性问题日益严重。含有乳酸菌的发酵产品食用前一般不进行加热或消毒等处理，耐药性基因可能通过食物链进入人体肠道并在肠道内积累和传播，对人体健康产生潜在的威胁[25]。选取常用的9 种抗生素，3 株乳酸菌的耐药试验结果见表3。供试3 株乳酸菌对9 种抗生素的敏感性参照美国临床和实验标准协会（CLSI）规定标准划分为敏感（S）、中度敏感（I）和耐药（R）3 个等级[25]。由表2可知，3 株乳酸菌对大部分抗生素均未产生耐药性，只对庆大霉素产生耐药性，而多数乳酸菌对氨基糖苷类抗生素具有天然耐受能力[25]。

表2 3 株乳酸菌耐药性检测结果Table 2 Three strains of lactic acid bacteria resistance test results

2.3.4.2 有害代谢物评价 3 株乳酸菌有害代谢物评价结果见表3。如果乳酸菌具有氨基脱羧酶活性，则可分解氨基酸生成胺和二氧化碳[26]。培养基pH 值升高，显碱性，滴加溴甲酚紫，呈黄色为阴性，说明没有发生脱羧反应；如呈紫色，则说明发生脱羧反应。试验结果显示，这3 株菌均表现出阴性反应，说明它们的代谢产物中均不含有氨基脱羧酶。硝酸盐还原酶可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐是强致癌物亚硝胺的前体物质[15]。3株乳酸菌硝酸还原酶试验结果显示，所有培养液均未变蓝，为阴性反应，说明3 株菌中不含有硝酸盐还原酶。通过吲哚试验可检测乳酸菌是否产生色氨酸酶，该酶能够分解色氨酸产生吲哚，色氨酸是人体必需氨基酸，色氨酸分解会引起肝功能衰退，恶性肿瘤等疾病[15]。吲哚试验中3 株乳酸菌的培养液均未变色，说明未产生吲哚类物质，试验结果为阴性。很多细菌会产生溶血素，使血液中的红细胞破裂溶解，3 株乳酸菌均没有溶血圈，说明它们对红细胞没有影响。

表3 3 株乳酸菌有害代谢物评价Table 3 Evaluation of harmful metabolites of three strains of lactic acid bacteria

3 讨论与结论

红茶菌中的乳酸菌有的是天然存在的，有的是人为加入的。植物乳杆菌和干酪乳杆菌都属于乳杆菌属，可发酵产酸、细菌素等多种抑菌物质，能够抑制和杀死发酵食品中的腐败菌和致病菌[27]。许多乳杆菌可产生挥发性物质，使发酵食品具有特殊风味。乳杆菌具有很多生理功能，包括耐受胃、肠环境，与人体上皮细胞黏附，增强机体免疫力，降低胆固醇，预防心血管疾病，促进营养物质吸收及维持肠道内菌群平衡等[28]。红茶菌中乳酸菌不仅有助于抑制红茶菌中杂菌和致病菌的生长，还可改善红茶菌的风味与口感，赋予红茶菌更多益生特性。

乳酸菌能发酵碳水化合物产生乳酸等有机酸，抑制有害微生物的生长繁殖，使产品质量得到有效控制。亚硝酸盐对环境和人类均造成严重危害，亚硝酸盐能形成具有强致癌作用的亚硝胺类物质，长期摄入可诱发癌变[29]，乳酸菌对亚硝酸盐有很好的降解作用[29]。本研究以产酸和降解亚硝酸盐能力为指标筛选优良乳酸菌。乳酸菌在发酵的前期，培养液pH 值＞4.5 时，乳酸菌对亚硝酸盐降解以亚硝酸盐还原酶降解为主；发酵后期，乳酸菌产生酸，培养液pH 值降低，pH 值＜4.0 后，亚硝酸盐的降解主要以酸降解为主[29]。其中HCR-20发酵27 h，发酵液pH 值降到2.7，产酸能力优于林龙镇等[30]从酸性风味食品中筛选的戊糖乳杆菌和发酵乳杆菌，且优于常见的保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌等[31]。HCR-20 发酵27 h 对亚硝酸盐降解率达99%，高于丁娟芳等[32]从扬州酱菜中筛选的乳酸肠球菌亚硝酸盐降解率为91.7%；程方方等[33]从酸马乳中筛选的肠膜明串珠菌亚硝酸盐降解率88.91%；吴慧昊等[34]从食品和动物肠道中筛选的玉米乳杆菌，亚硝酸盐降解率达到93.47%。

乳酸菌若要发挥改善肠道菌群结构、抑制肠道致病菌等功能则要求其能够克服胃、肠道中的物理及化学因素的影响，以活菌状态到达胃、肠道[9]。HCR-8，HCR-20 和HCR-24 经人工胃液和肠液处理后均有一定的存活率。乳酸菌进入人体后，具有良好的肠道黏附性能，最终定殖于肠道发挥其益生特性。HCR-20 对氯仿的疏水性大于80%，HCR-8 和HCR-20 对二甲苯的疏水性大于50%。3 株乳酸菌的自凝聚性随着时间的延长逐渐增大，HCR-20 对Caco-2 细胞的黏附率达17%。通过对3 株乳酸菌的安全性评价可知：3 株菌对大部分常见的抗生素均无抗性；不会产生氨基脱羧酶和色氨酸酶，不含有硝酸还原酶，不会产生溶血现象。

本试验从红茶菌中筛选的3 株乳酸菌，具有良好的降解亚硝酸盐能力，能耐受胃、肠道环境，不会产生有害代谢产物，为特定功能益生菌的开发利用提供参考依据。