李涛，孟丹丹，郭水良，袁国徽，钱振官，吕卫光*

1. 上海市农业科学院，上海 201403；2. 上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234

被称为“生态系统工程师”的蚯蚓，是土壤系统的重要组成部分（Ojha et al.，2014），在改良土壤、消解农业废弃物、提高土壤养分和作物产量方面发挥着重要的作用（吴娜娜等，2015；Manono，2016）。蚯蚓是土壤大型无脊椎动物的代表，其生物量约占土壤动物生物量的 60%—80%（Jouquet et al.，2010）。蚯蚓数量被认为是土壤健康和衡量农业可持续发展的有效指标（Blouin et al.，2013；郭佳惠等，2016）。以农用化学品高投入为特点的现代集约农业在过去几十年中取得了巨大的成功，但是农药化肥的大量使用也对生态环境造成了污染（Hackenberger et al.，2018）。农药是土壤污染物的重要来源（付青等，2019；谭华东等，2021），土壤中的蚯蚓可通过皮肤直接接触或取食土壤中受污染的食物而接触农药，从而引起蚯蚓死亡或影响其生长（Wang et al.，2000）。蚯蚓对土壤中的污染物较为敏感，是开展土壤生态风险评估的重要指示生物（宋雪英等，2016；张慧琦等，2017）。

中国是农药生产和使用大国，农药作为重要的生产资料，在防治有害生物，保障农业生产安全方面发挥了重要的作用，但是长期大量使用农药也给中国生态环境造成了一定的负面影响（蒲生彦等，2019）。中国农药管理部门越来越重视农药对生态环境的安全评价，但是大部分的研究主要着眼于农药对鸟类、鱼类和蜜蜂的负面影响，有关农药对蚯蚓等土壤动物的影响还未受到足够的重视（姜锦林等，2014）。近年来，关于农药对蚯蚓毒性的研究在国内外已有一些报道，但所涉及的品种主要为杀虫剂和杀菌剂（陈爱梅等，2013；林涛等，2015）。使用的化学农药中，除草剂占比最大，发达国家除草剂用量占市场上所有农药用量的 70%以上，并在未来有进一步上升的趋势（Muthukaruppan et al.，2005）。截至目前，有关除草剂对蚯蚓毒性的研究较少，生产中常用除草剂对蚯蚓毒性还不明确。王彦华等（2012）研究了22种除草剂对蚯蚓的急性毒性，其中的特丁津、莎稗磷、乙草胺、丙草胺和精异丙甲草胺采用滤纸接触法测定时对蚯蚓表现为中等毒性。林涛等（2015）采用药土法测定了2, 4-D二甲胺盐对蚯蚓的急性毒性，表现为低毒。在已发表的有关除草剂对蚯蚓急性毒性的文献资料中，大部分供试除草剂都是一些较老的品种，在当前的农业生产中已不常用，部分品种甚至已经被禁用如甲磺隆和百草枯等。因此，本研究的目标是：测定当前农业生产中常用的 17种除草剂对蚯蚓的急性毒性，明确除草剂对蚯蚓的剂量-毒性效应关系，为评估除草剂对蚯蚓的生态风险提供数据信息，同时为安全、科学使用除草剂提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 供试除草剂

选择当前农业生产中广泛使用的 17种除草剂开展试验，供试除草剂原药如下：90%二氯喹啉酸（quinclorac），江苏省激素研究所股份有限公司生产；96%灭草松（bentazone），安徽丰乐农化有限责任公司生产；95% 2甲4氯钠（MCPA-Na），江苏健谷化工有限公司生产；96%噁唑酰草胺（metamifop），安徽众邦生物工程有限公司生产；95%双草醚（bispyribac-sodium）、98%吡嘧磺隆（pyrazosulfuron-ethyl），江苏瑞邦农化股份有限公司生产；98%五氟磺草胺（penoxsulam），美国陶氏益农公司生产；95%嘧啶肟草醚（pyribenzoxim），安徽圣丰生化有限公司生产；97%氰氟草酯（cyhalofop-butyl），江苏中旗科技股份有限公司生产；98%丙草胺（pretilachlor），山东滨农科技有限公司生产；95%草铵膦（glufosinate ammonium），利尔化学股份有限公司生产；97%高效氟吡甲禾灵（haloxyfop-R-methyl）、95%乙羧氟草醚（fluoroglycofen），江苏长青农化股份有限公司生产；96%二甲戊灵（pendimethalin），山东天成生物科技有限公司生产；97%苯唑草酮（topramezone），巴斯夫欧洲公司生产；97%硝磺草酮（mesotrione），江苏丰山集团股份有限公司生产；95%烟嘧磺隆（nicosulfuron），江苏龙灯化学有限公司生产。所有供试除草剂原药均从市场购买获得。

1.2 供试蚯蚓

供试蚯蚓为赤子爱胜蚓（Eisenia fetida），由上海瀛西果蔬专业合作社提供。试验开始前先在室内装有土的周转箱中预养15 d（20—25 ℃，相对湿度60%—70%）。挑选大小一致且环带明显的健康蚯蚓开展试验，蚯蚓个体质量400—500 mg。按照Fründ et al.（2010）推荐的方法检查蚯蚓的健康状态。

1.3 试验方法

1.3.1 滤纸接触法

参照欧洲共同体推荐的滤纸接触法（OECD，1984），并略做改进（用培养皿代替了平底玻璃管），开展试验。在直径10 cm的培养皿中，内置一层相同直径大小的滤纸。每个培养皿添加2 mL用丙酮溶解配制的药液，并放置在通风橱中24 h，待丙酮完全挥发后加入2 mL蒸馏水润湿滤纸，同时加入1条蚯蚓。蚯蚓加入前先被置于湿润的滤纸上清肠24 h（20 ℃，全黑），以排空其肠道内容物。将添加了药液和蚯蚓的培养皿置于20 ℃，相对湿度75%的人工气候箱（MLR-352H，Sanyo Electric Co.，Ltd.，Osaka，Japan）中黑暗培养，分别于24 h和48 h调查并记录蚯蚓死亡数，以蚯蚓前尾部对机械刺激无反应视为死亡。死亡率按照下式计算：

式中：

P为死亡率；

Pt为处理组死亡率；

C为对照组死亡率。当对照组死亡率低于10%时为有效测定数据。

正式试验之前，先进行了选择药剂有效浓度范围的预试验，求出每个供试药剂对蚯蚓全致死的最低浓度和全存活的最高浓度，并在此范围内设置正式试验的浓度。每个药剂设置5个浓度，以添加丙酮的处理为对照。10条蚯蚓为一组，并视为1次重复，整个试验重复3次。

1.3.2 人工土壤法

参照欧洲共同体推荐的标准方法配制人工土壤（Oecd，1984）。人工土壤由10%泥炭藓、20%高岭土、69%石英砂和 1%碳酸钙组成。将供试除草剂原药用丙酮溶解后拌于10 g石英砂中，待丙酮完全挥发后与490 g人工土壤充分混匀，加入蒸馏水调节人工土壤含水量至35%。将含有药剂的人工土壤装入1250 mL的黑色带盖塑料盒中，每个塑料盒添加10条预先在人工土壤中驯养并清肠24 h的蚯蚓。塑料盒盖上钻有通气孔，便于气体交换。塑料盒置于20 ℃，相对湿度75%的人工气候箱中光照黑暗各12 h培养（光照强度400—800 lx）。分别于7 d和14 d调查蚯蚓死亡数，计算死亡率。死亡判断标准和死亡率计算公式同滤纸接触法。

正式试验之前，先进行了选择浓度范围的预试验，通过设置 0.1、1、10、100、1000 mg·kg−15个质量分数，以确定导致蚯蚓 0—100%死亡率的浓度范围。并根据确定的浓度范围，每个药剂设置5—7个供试浓度，每个浓度设置3次重复，以添加丙酮的人工土壤为对照。

1.4 数据处理

试验所得数据采用DPS 7.5统计软件进行处理，以供试除草剂浓度的对数值和蚯蚓死亡率的几率值进行回归分析，计算半数致死浓度（median lethal concentration，LC50）、95%置信限和相关系数r。滤纸接触法测定的毒性分级标准为（Roberts et al.，1984）：LC50≤1.0 μg·cm−2，剧毒；1.0 μg·cm−21000.0 μg·cm−2，微毒。人工土壤法测定的毒性分级采用 GB/T 31270.15—2014化学农药环境安全评价试验准则第15部分：蚯蚓急性毒性试验（中华人民共和国农业部，2014）中提出的标准：LC50≤0.1 mg·kg−1，剧毒；0.110.0 mg·kg−1，低毒。

2 结果与分析

采用滤纸接触法和人工土壤法开展试验期间，丙酮对照组的蚯蚓生长正常，未见死亡，表明本试验数据合理有效。

2.1 滤纸接触法测定结果

滤纸接触法测定结果见表 1。研究表明，除草剂对赤子爱胜蚓的毒性与除草剂品种及染毒时间有关。赤子爱胜蚓与除草剂接触后，部分处理的蚯蚓出现身体卷曲（图1a、b）、体节肿大充血（图1c、d）、身体断裂糜烂等症状（图1e、f）。滤纸接触法染毒24 h调查，噁唑酰草胺对赤子爱胜蚓的毒性最高，LC50为 9.9 μg·cm−2，属高毒级；其次为丙草胺、高效氟吡甲禾灵、灭草松，LC50分别为 14.8、33.3、73.4 μg·cm−2，属中毒级；再次为二氯喹啉酸、2甲4氯钠、苯唑草酮、双草醚，LC50分别为 161.8、252.4、266.4、908.3 μg·cm−2，属低毒级；烟嘧磺隆、草铵膦、二甲戊灵、乙羧氟草醚、吡嘧磺隆、氰氟草酯、五氟磺草胺、硝磺草酮、嘧啶肟草醚对赤子爱胜蚓的 LC50均大于1000.0 μg·cm−2，属微毒级。随着染毒时间的延长，供试除草剂对赤子爱胜蚓的毒性有所增加。滤纸接触法染毒48 h调查，噁唑酰草胺对赤子爱胜蚓的毒性依然最高，LC50为 7.6 μg·cm−2，属高毒级；其次为丙草胺、高效氟吡甲禾灵、灭草松，LC50分别为 10.7、12.7、61.3 μg·cm−2，属中毒级；再次为二氯喹啉酸、2甲4氯钠、苯唑草酮、草铵膦、双草醚，LC50分别为143.0、198.2、211.1、466.9、649.2 μg·cm−2，属低毒级；二甲戊灵、乙羧氟草醚、吡嘧磺隆、氰氟草酯、五氟磺草胺、硝磺草酮、嘧啶肟草醚对赤子爱胜蚓的 LC50均大于 1000.0 μg·cm−2，属微毒级。

图1 除草剂对赤子爱胜蚓的形态异常特征Fig. 1 Morphological abnormalities of the herbicides on Eleusine fetida

表1 采用滤纸接触法测定的除草剂对赤子爱胜蚓的急性毒性Table 1 Acute toxicity of herbicides to Eisenia fetida by using filter paper contact test

2.2 人工土壤法测定结果

人工土壤法测定结果见表 2。与滤纸接触法测定的结果类似，采用人工土壤法测定时，不同除草剂对赤子爱胜蚓的毒性同样与除草剂品种及染毒时间有关。人工土壤法染毒7 d调查，高效氟吡甲禾灵对赤子爱胜蚓的毒性最高，LC50为181.6 mg·kg−1；其次为 2甲 4氯钠、丙草胺、二甲戊灵、烟嘧磺隆，LC50分别为 340.3、423.1、480.3、754.5 mg·kg−1；二氯喹啉酸、灭草松、噁唑酰草胺、双草醚、乙羧氟草醚、苯唑草酮、草铵膦、吡嘧磺隆、氰氟草酯、五氟磺草胺、硝磺草酮和嘧啶肟草醚对赤子爱胜蚓的毒性相对较低，LC50均大于 800.0 mg·kg−1。随着染毒时间的延长，供试除草剂对赤子爱胜蚓的毒性有所增加。人工土壤法染毒14 d调查，高效氟吡甲禾灵对赤子爱胜蚓的毒性依然最高，LC50为 148.9 mg·kg−1；其次为丙草胺、2甲 4氯钠、二甲戊灵、噁唑酰草胺、苯唑草酮、灭草松、烟嘧磺隆、二氯喹啉酸和嘧啶肟草醚，LC50分别为 211.5、335.0、342.4、345.7、573.3、649.5、703.1、715.0、743.6 mg·kg−1；双草醚、乙羧氟草醚、草铵膦、吡嘧磺隆、氰氟草酯、五氟磺草胺和硝磺草酮对赤子爱胜蚓的毒性相对较低，LC50均大于 800.0 mg·kg−1。根据《化学农药环境安全评价试验准则》中的分级标准，采用人工土壤法测定的 17种除草剂对赤子爱胜蚓的毒性等级均为低毒级。

表2 采用人工土壤法测定的除草剂对赤子爱胜蚓的急性毒性Table 2 Acute toxicity of herbicides to Eisenia fetida by using artificial soil test

3 讨论

急性毒性试验对评估化学品对蚯蚓的生态风险具有重要的作用。据Heimbach（1992）报道，急性毒性试验的结果与实际观察到的影响之间具有较好的相关性。开展除草剂对蚯蚓的急性毒性试验，可以快速对除草剂的毒性做出初步的判断。测定蚯蚓急性毒性的方法很多，例如滤纸接触法、人工土壤法、饲喂法、注射法、浸入法、点滴法、强迫摄食法和自然土壤法（Wang et al.，2012a），其中滤纸接触法和人工土壤法受到的关注最多，并被OECD列为开展化学品对蚯蚓急性毒性试验的标准方法（OECD，1984）。滤纸接触法易操作、速度快、可重复性好，反映了除草剂对蚯蚓的经皮毒性，常作为预试验或应急预警的试验方法（Tripathi et al.，2010）。人工土壤法模拟了蚯蚓生活的自然环境，测定结果较客观，反映了除草剂被蚯蚓肠道吸收后的毒性（Udovic et al.，2010）。本研究同时采用滤纸接触法和人工土壤法开展试验，可以更全面地了解供试除草剂对蚯蚓的毒性。

除草剂是全世界使用量最大的农药类别，蚯蚓死亡率与除草剂使用之间的关系仍不明确。以往的研究表明，有些除草剂对蚯蚓有直接毒性，而有些除草剂则没有影响（Zarea et al.，2012）。现代除草剂的创制朝着高效、低毒的方向发展，除草剂对蚯蚓的毒性一般较低，但也有一些例外。本研究结果进一步验证了上述结论，本次测定，不同除草剂之间对蚯蚓的毒性差异较大。采用滤纸接触法测定，噁唑酰草胺对赤子爱胜蚓属高毒级；丙草胺、高效氟吡甲禾灵和灭草松对赤子爱胜蚓属中毒级；二氯喹啉酸、2甲 4氯钠、苯唑草酮、草铵膦、烟嘧磺隆和双草醚对赤子爱胜蚓属低毒级；吡嘧磺隆、五氟磺草胺、嘧啶肟草醚、氰氟草酯、乙羧氟草醚、二甲戊灵和硝磺草酮属微毒级。采用人工土壤法测定，高效氟吡甲禾灵对赤子爱胜蚓毒性最高；其次为丙草胺、2甲 4氯钠、二甲戊灵和噁唑酰草胺；人工土壤法测定的17种除草剂对赤子爱胜蚓均为低毒级。王彦华等（2012）采用滤纸接触法和人工土壤法测定了草铵膦、丙草胺、氰氟草酯对赤子爱胜蚓的急性毒性，测定结果与本研究一致。

除草剂对蚯蚓的毒性结果与测定方法的选择有关。滤纸接触法中，除草剂黏附在滤纸表面，蚯蚓通过体表直接接触药剂，对药剂的吸收量大，吸收速率快。人工土壤法中，药剂被土壤胶体和有机质吸附，受环境的影响，还会发生降解，从而降低了蚯蚓对药剂的吸收（Saxena et al.，2014）。本研究同时采用滤纸接触法和人工土壤法测定除草剂对赤子爱胜蚓的毒性，结果虽然略有不同，但整体趋势一致。无论是采用滤纸接触法还是人工土壤法，噁唑酰草胺、高效氟吡甲禾灵、丙草胺、灭草松和2甲4氯钠对赤子爱胜蚓均表现出相对较高的毒性。Wang et al.（2012b）研究表明，不同化学结构的农药对蚯蚓的毒性差异较大。本次测定，滤纸接触法中毒性最高的噁唑酰草胺和人工土壤法中毒性最高的高效氟吡甲禾灵，从化学结构看都属于芳氧苯氧基丙酸酯类除草剂，该类除草剂可能对蚯蚓具有相对较高的毒性。

近年来，在上海都市农业中，种植户为了增加土壤中蚯蚓的数量，开始实施和推广往农田接种蚯蚓的作法，接种蚯蚓后的农田，如何安全使用除草剂，是种植户最关心的问题之一。本研究可为接种蚯蚓的农田安全使用除草剂提供技术指导。本研究仅测定了除草剂对蚯蚓的急性毒性效应。事实上，在自然的土壤环境中常存在多种除草剂长期低剂量暴露，其对蚯蚓的生态风险不容忽视（王飞菲等，2014）。下一步需要更多地研究多种除草剂联合暴露对蚯蚓的毒性效应，以便进行充分的生态风险评估。

4 结论

除草剂是全世界使用量最大的农药类别，开展除草剂对蚯蚓的生态风险评估意义重大。本研究测定的 17种除草剂，大部分对蚯蚓的毒性较低，但不同除草剂之间差异较大。采用滤纸接触法试验，噁唑酰草胺对赤子爱胜蚓属高毒级；丙草胺、高效氟吡甲禾灵和灭草松属中毒级；二氯喹啉酸、2甲 4氯钠、苯唑草酮、草铵膦、烟嘧磺隆和双草醚属低毒级；吡嘧磺隆、五氟磺草胺、嘧啶肟草醚、氰氟草酯、乙羧氟草醚、二甲戊灵和硝磺草酮属微毒级。采用人工土壤法试验，高效氟吡甲禾灵对赤子爱胜蚓的急性毒性最高；其次为丙草胺、2甲 4氯钠、二甲戊灵、噁唑酰草胺、苯唑草酮和灭草松。采用人工土壤法测定的17种除草剂对赤子爱胜蚓均为低毒级。本研究可为评估除草剂对蚯蚓的生态风险提供新的数据信息，同时可为农业生产中安全使用除草剂提供技术指导。