郝 南，农德勇，李 钻，林俊浩，黄桂海，李锡明，李 伟

肿瘤是一种全球范围内威胁人类健康的疾病。一项发表在Lancet杂志上的研究报告指出，恶性肿瘤是中国城乡居民第三大死亡原因[1]。肿瘤增殖失控、侵袭和远处转移等恶性生物学行为是导致患者预后不良的主要原因[2]。3-磷脂酰肌醇依赖的蛋白激酶-1(3-phosphoinositide dependent protein kinase-1,PDK1)是环磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)和环磷鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)依赖的激酶和蛋白激酶c家族的重要成员，其可通过调控细胞增殖、凋亡、分化、成熟等参与胃癌、乳腺癌及卵巢癌的发生、浸润、转移和复发的过程[3-5]。本课题组的前期研究[6]发现，沉默PDK1可抑制前列腺癌细胞的增殖、侵袭和转移，提示PDK1可能是前列腺癌治疗的新靶标。鉴此，本研究旨在构建PDK1基因的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)慢病毒载体并鉴定其干扰效应。

1 材料与方法

1.1主要实验材料 本研究实验所用主要材料见表1。

表1 实验主要材料

1.2PDK1-shRNA干扰序列的设计与合成 在GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中检索PDK1基因序列，根据shRNA引物序列设计原则，设计并合成PDK1-shRNA序列。见表2。

表2 PDK1、PDK1-shRNA、转录产物和重组质粒序列

1.3LV3-PDK1-shRNA载体构建

1.3.1 载体酶切和去磷酸化 应用限制性内切酶BamH I和EcoR I剪切载体质粒LV3，加入50 μl虾碱性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)体系去磷酸化，切胶回收目的载体。

1.3.2 shRNA序列退火 将合成的shRNA序列用pH=8.0的TE缓冲液(Tris-EDTA buffer solution)溶解，浓度为100 μM。取相应的正义链和反义链寡核苷酸(oligo)序列溶液进行退火反应。退火后，将模板溶液稀释50倍，终浓度为200 nM，用于后续的连接反应。

1.3.3 连接反应 将载体LV3线性化的酶切产物与shRNA序列进行定向连接。

1.3.4 连接产物转化感受态细胞 使用制备感受态细胞试剂盒将293T细胞制备成感受态细胞并保存于-80 ℃备用。……