李婉媚 杨旭斌 黄懿文 陈雪雁

1广州市第十二人民医院内分泌内科（广州510620）；2中山大学附属第三医院内分泌与代谢病学科（广州510630）

心脏自主神经病变（CAN）是糖尿病重要的并发症之一，可引起患者体位性低血压、持续性心动过速及无痛性心肌梗死等，可显著增加糖尿病的病死率［1-2］。研究证实，血糖升高是导致CAN 的关键因素［3］。有研究提示，糖化血红蛋白控制在良好范围内，仍不能完全减少CAN 的发生和发展［4］。笔者前期研究［5］发现，血糖波动较持续性高血糖更容易引起CAN，而相关机制未明。已有报道，血糖波动导致糖尿病相关并发症的核心因素之一在于炎症因子［1］。但目前关于血糖波动导致CAN 的机制研究尚未见报道。为此，本研究通过建立糖尿病血糖波动大鼠模型，探讨血糖波动对糖尿病大鼠心脏自主神经功能的影响以及炎症因子在其中可能的作用机制，为临床上改善心脏自主神经功能、减少相关的病死率提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选取45 只雄性SPF 级别大鼠，体质量在260 ～300 g 之间，周龄均为8 周，由上海剑钝生物科技有限公司提供。

1.2 试剂及材料 酶联免疫吸附法试剂盒：肿瘤坏死因子（TNF-α）试剂盒购于上海慧颖生物科技有限公司；白细胞介素6（IL-6）试剂盒购于齐一生物科技（上海）有限公司；白细胞介素1β（IL-1β）试剂盒购于上海江莱生物科技有限公司。

反映心脏自主神经功能的因子：睫状生长因子（CNTF）试剂盒购于上海沪震实业有限公司；神经生长相关蛋白（GAP-43）购于上海钰博生物科技有限公司；神经生长因子（NGF）试剂盒购于上海科顺生物科技有限公司；乙酰胆碱酶转移酶（CHAT）购于上海信裕生物科技有限公司、络氨酸氢化酶（TH）试剂盒购于南京森贝伽生物科技有限公司；链脲佐菌素（STZ）购于上海艾研生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糖尿病模型制备 45 只SD 大鼠中，随机抽取15 只为空白对照组（NC 组），另外30 只大鼠按照60 mg/kg 的比例注射STZ 制备糖尿病模型，连续2 次随机血糖＞16.7 mmol/L 即模型成功。之后将其随机分为持续高血糖组（DS 组）和波动高血糖组（DF 组），各15 只。DF 组在注射STZ 糖尿病大鼠模型基础上参考国际公认的AZUMA 等［7］造模方法制造血糖波动大鼠模型。DF 组每天定时（上午8点，下午2点）葡萄糖灌胃（2.5 g/kg），每天定时（上午9点，下午3点）给予3U的胰岛素腹腔注射，DS组和NC 组每天相应时间给予等量生理盐水［6］。每天检测7：30、9：30、11：30、13：30、17：30、19：30 血糖，并计算各组日内血糖波动的评价参数如血糖标准差（SDBG）、最大血糖波动幅度（LAGE）。DF组空腹血糖波动于7.8 ～16.7 mmol/L，餐后血糖在11.1 ～33.3 mmol/L，且SDBG和LAGE显著高于持续高血糖组时，则为造模成功［7-8］。

1.3.2 指标检测 所有大鼠喂养4 周以后，隔夜禁食，采用4%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，将大鼠心脏开胸取出后，立即分离心脏，切取有心脏表面神经节丛存在的心脏脂肪垫并制成匀浆液备用，采用酶联免疫吸附法对心脏表面神经节丛匀浆液进行TH、CHAT、NGF、GAP-43、CNTF 及TNF-α、IL-1β、IL-6 水平测定［9］。

1.4 统计学方法 采用统计学软件SPSS 19.0 对上述资料进行整理分析，其中计量资料采用均数±标准差表示，通过单因素方差分析对组间资料进行比较，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组一般情况变化 4 周后，NC 组大鼠摄水摄食量较正常，毛发光洁，精神状态良好。DS 组和DF 组大鼠出现不同程度的萎靡消瘦，毛乱无光泽，多尿多食多饮；且与DS 组相比较，DF 组大鼠体质量更轻，活动更少，标准差（SDBG）、最大血糖波动幅度（LAGE）更高（P＜0.05）。见表1。

表1 各组大鼠喂养4 周后一般情况变化Tab.1 Characteristics of the rats among groups after 4 weeks ±s

表1 各组大鼠喂养4 周后一般情况变化Tab.1 Characteristics of the rats among groups after 4 weeks ±s

注：与NC 组相比，*P ＜0.001；与NC 组相比，#P ＜0.001；与DS 组相比，△P ＜0.001

组别NC组DS组DF组F值P值例数15 15 15体质量（g）511.26±26.51 359.54±23.19#219.65±14.92*△47.382＜0.001 HbA1c（%）4.59±0.51 11.23±0.58#11.10±0.46*23.457＜0.001 SDBG（mmol/L）0.75±0.33 1.78±0.55#4.21±0.48*△16.743＜0.001 LAGE（mmol/L）1.58±0.45 5.42±0.61#12.78±1.14*△20.491＜0.001

2.2 各组大鼠心脏自主神经匀浆液中CHAT、TH及TH/CHAT 水平比较 4 周后，与NC 组相比，DS组和DF 组大鼠TH 和TH/CHAT 水平明显升高，CHAT 明显降低，且DF 组大鼠上述指标变化更为显著（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠中TH、CHAT 及TH/CHAT 水平比较Tab.2 Comparison of TH、CHAT and TH/CHAT among groups after 4 weeks ±s

表2 各组大鼠中TH、CHAT 及TH/CHAT 水平比较Tab.2 Comparison of TH、CHAT and TH/CHAT among groups after 4 weeks ±s

注：与NC 组相比，*P ＜0.001；与NC 组相比，#P ＜0.001；与DS组相比，△P ＜0.05

组别NC 组DS 组DF 组F 值P 值例数15 15 15 TH/CHAT（ng/mL）0.92±0.08 1.54±0.15#1.97±0.21*△31.185＜0.001 CHAT（ng/mL）41.15±6.54 27.26±4.87#22.19±3.76*△26.462＜0.001 TH（ng/mL）34.26±5.19 41.69±6.29#45.33±6.38*△19.326＜0.001

2.3 各组大鼠心脏自主神经匀浆液中神经营养因子水平比较 4周后，与NC组相比，DS组和DF组大鼠GAP-43 和NGF 水平明显升高，CNTF 明显降低，且DF 组大鼠上述指标变化更为显著（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠中神经营养因子水平比较Tab.3 Comparison of CNTF，GAP-43 and NGF amonggroups after 4 weeks ±s

表3 各组大鼠中神经营养因子水平比较Tab.3 Comparison of CNTF，GAP-43 and NGF amonggroups after 4 weeks ±s

注：与NC 组相比，*P ＜0.001；与NC 组相比，#P ＜0.001；与DS组相比，△P ＜0.05

组别NC 组DS 组DF 组F 值P 值例数15 15 15 CNTF（ng/mL）31.74±6.59 18.54±5.29#16.02±4.26*△34.375＜0.001 GAP-43（ng/mL）112.69±15.64 129.36±15.95#137.88±16.19*△26.284＜0.001 NGF（ng/mL）312.58±36.87 368.25±38.39#379.08±36.28*△25.825＜0.001

2.4 各组大鼠心脏自主神经匀浆液中IL-1β、IL-6及TNF-α水平比较 4 周后，与NC 组相比，DS 组和DF 组大鼠TNF-α、IL-6 及IL-1β水平明显升高，且DF 组大鼠上述炎症指标升高更为显著（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠中TNF-α、IL-6 及IL-1β水平比较Tab.4 Comparison of TNF-α，IL-6 and IL-1βamong groups after 4 weeks

3 讨论

目前认为糖尿病心脏自主神经病变的主要机制为副交感神经异常、轴突性神经病变、高糖毒性、交感-迷走神经紊乱、神经营养等多因素相互影响，致使迷走神经和交感神经损伤，发生心脏自主神经病变［10-11］。研究显示，较大的血糖波动会增加慢性并发症的风险［12］。与持续性高血糖相比，间断性的高血糖更能诱导机体副交感神经发生异常，致使心脏自主神经病变的发生［13］。然而，其相关机制仍不明确。本研究发现，随着血糖波动幅度等指标的升高，反映心脏自主神经功能损害及再生的相关因子GAP-43、CNTF、NGF、CHAT 以及TH 呈现显著变化。刘红梅等［14］研究发现血糖波动与持续高血糖相比，炎症因子TNF-α，IL-6和IL-1β相关蛋白表达水平升高，考虑血糖波动是造成炎性因子变化的主要原因。

糖尿病大鼠中，神经因子等的改变是反映心脏自主神经功能的重要提示。GAP-43 为交感神经芽生的标志物，糖尿病时心脏中GAP-43 过度表达标志着神经损伤后出现重构现象［15］。在体外研究中，CNTF 可以促进鸡胚副交感睫状节神经元的存活，同时，有较强的促进迷走神经作用［16］。另一个神经因子NGF 在机体交感神经重构中同样发挥重要的作用，而在心脏自主神经功能调节异常时NGF 呈升高趋势［17-18］。而CHAT 和TH 可分别有效反映迷走神经和交感神经活性。TH/CHAT 的比值可有效反映迷走神经和交感神经之间的平衡性［19］。本研究结果显示，血糖波动组GAP-43 和NGF 水平明显升高，表明交感神经得到一定程度的修复，而CNTF 水平相对较低，表明迷走神经恢复较弱，最终导致交感神经亢进迷走神经损伤，交感和迷走神经平衡紊乱，引发心脏自主神经功能变化［20］。因此，血糖波动可能通过多个神经因子的改变从而导致心脏自主神经调节的异常，最终引起糖尿自主神经病变的发生。相对于持续高血糖，血糖波动带来的神经因子表达水平改变更显著，从而心脏自主神经功能的损害也更明显。

然而，血糖波动如何促使神经因子异常表达进而导致心脏自主神经病变的发生、发展尚未明确。既往研究发现，炎症因子与神经因子存在显著的关联［21］。在中心性肥胖的人群［22］或帕金森的患者中，CHAT 和TH 与炎症因子如IL-1β和IL-6 存在相关性［23］。而在炎症因子与GAP-43 相关性分析的研究中，GU 等［24］发现，在使用木犀草素进行干预的糖尿病视网膜病变患者中，GAP-43 的升高与IL-1β和TNF-α的变化相关。体外及体内研究均已明确，NGF 可显著减少血糖升高所引起的炎症因子释放，从而缓解糖尿病并发症［25-26］。然而血糖波动与炎症因子及神经因子的关联却尚未见报道。本研究发现，随着血糖波动增大，神经因子变化的同时伴随着炎症因子的显著升高，提示炎症因子在血糖波动时，在自主神经功能发生异常过程中发挥重要的桥梁作用。这可能是由于血糖波动引发神经营养因子发生变化，诱导神经损伤，而血糖波动亦可能促使TNF-α和IL-1β水平升高，促进髓鞘磷脂的吞噬，加重神经的损伤，出现神经因子的异常［22-27］。另外，炎症因子也参与血管内皮损伤及胰岛素抵抗，在一定程度上加重微血管损伤，进而引发心脏自主神经损伤［28］。因此笔者认为，在糖尿病大鼠中，血糖波动导致炎症因子与神经相关因子相互影响，从而损害心脏自主神经功能。

本研究探讨血糖波动影响心脏自主神经功能的可能机制，分析炎症因子在其中可能的影响，为今后的心脏自主神经病变提供可能的靶点［29］。然而本研究尚存在一定的局限：（1）本研究未深入探讨血糖波动、炎症因子及心脏自主神经功能改变间相互影响的可能的信号通路；（2）本研究未进一步对血糖波动及炎症因子进行干预，明确改善心脏自主神经的方式。

综上所述，血糖波动可通过影响神经营养因子及炎症因子水平，引发交感-迷走神经紊乱，加剧大鼠心脏自主神经功能改变［30］；血糖波动比持续性高血糖对相关指标的影响更大；故而减少血糖波动进一步减轻炎症因子的影响可能成为改善糖尿病心脏自主神经病变的新治疗靶点。在本研究的基础上，下一步将通过对信号通路的研究深入分析血糖波动引起炎症因子释放导致心脏自主神经病变的机制，并拟采用药物干预的措施探讨减少血糖波动而带来的心脏自主神经功能的改善。