苹果黑腐皮壳菌CAP超家族蛋白基因鉴定及毒性功能分析

2021-09-02王程利尹志远聂嘉俊林永辉黄丽丽

中国农业科学 2021年16期

王程利，尹志远，聂嘉俊，林永辉，黄丽丽

王程利，尹志远，聂嘉俊，林永辉，黄丽丽

西北农林科技大学植物保护学院/旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌 712100

【】CAP（Cysteine-rich secretory protein，Antigen 5 and Pathogenesis related protein 1）超家族蛋白广泛存在于真菌、细菌、动植物等物种，并且参与病原菌的致病过程。本研究旨在鉴定苹果树腐烂病致病菌——苹果黑腐皮壳菌（）的CAP超家族基因并明确CAP超家族基因在病菌致病方面的作用。通过BLASTP在苹果黑腐皮壳菌全基因组中检索具有CAP保守结构域的基因；利用特异性引物对鉴定到的CAP基因进行PCR扩增和凝胶电泳检测；使用生物信息学软件和在线数据库进行蛋白序列特征和系统发育分析；利用RT-qPCR分析基因在病菌侵染过程中的表达模式；使用特异性引物扩增CAP基因上、下游片段并从PDL2质粒上扩增筛选标记基因；利用Double-joint PCR构建基因敲除盒并通过PEG介导的原生质转化技术进行基因敲除和基因回补；以遗传霉素（G418）抗性为筛选标记并利用4对引物PCR检测获得基因敲除突变体；以潮霉素（HPH）抗性为筛选标记获得基因回补菌株；通过对菌株进行培养皿内生长试验明确基因对病菌营养生长的影响；通过离体苹果枝条接种试验分析该病菌CAP超家族基因的毒性功能。在苹果黑腐皮壳菌中鉴定到3个具有CAP保守结构域的基因，分别命名为、和。序列特征分析发现，3个CAP蛋白均包含4个保守区：N端信号肽、N端延伸区（NTE）、CAP保守功能域和C端延伸区（CTE）。系统发育分析显示，3个CAP蛋白聚于不同的进化支，VmPR1a聚于clade2进化支并与粗糙链孢霉（）CAP蛋白进化关系较近；VmPR1b聚于clade3且与镰孢菌属（spp.）CAP蛋白的进化关系更近；VmPR1c聚于clade1，并且也与粗糙链孢霉的CAP蛋白进化关系较近。RT-qPCR分析结果显示，、和在病菌侵染早期（6 h和12 h）均显著上调表达。利用PEG遗传转化技术获得、和敲除突变体（Δ-7/23、Δ-20/31和Δ-26/40）；营养生长观察发现，所有敲除突变体生长表型与野生型菌株03-8均无明显差异；致病力检测发现，Δ-20/31致病力较野生型无明显变化，而Δ-7/23和Δ-26/40致病力较野生型显著下降。将和分别回补至Δ和Δ，回补菌株（/C和/C）致病力恢复至野生型水平。苹果黑腐皮壳菌中存在3个CAP超家族基因（、和），其中和是苹果黑腐皮壳菌重要的毒性因子。

苹果黑腐皮壳菌；CAP 蛋白；基因鉴定；基因敲除；毒性功能

0 引言

【研究意义】由苹果黑腐皮壳菌（）引起的苹果树腐烂病是一种分布广泛、危害严重、防治困难的枝干性病害。苹果树腐烂病的发生造成树势衰弱、枯死甚至毁园，导致苹果产量及品质大幅下降，严重制约我国苹果产业的发展。目前对苹果黑腐皮壳菌的毒性因子鉴定以及致病机制研究尚不充分，给病害的防控带来挑战。发掘病原菌新的毒性因子，解析病原菌的致病机理对苹果树腐烂病的综合防治具有重要意义。【前人研究进展】CAP超家族蛋白由CRISP、Antigen 5和PR-1三大类蛋白组成，该家族蛋白除了含有一个保守的CAP区域和折叠的三级结构特征以外，多数成员含有一个C端延伸区[1]。CAP超家族蛋白分布广泛，涉及生物体的生长、生殖、致病、免疫调节等多种生命过程。在动物中，昆虫分泌的CAP蛋白Antigen 5能引起宿主过敏反应、抑制免疫和防止宿主血液凝结[2]。蛇和吸血虫的毒液中存在的CRISP蛋白也参与对生物的毒杀作用[3-4]。蜗牛、马蜂等动物毒液中CAP蛋白功能的发挥依赖于CAP保守区域[5-6]。在植物中，典型的CAP蛋白PR-1在植物依赖水杨酸（SA）防御信号通路中大量表达，被认为是水杨酸信号通路直接参与寄主防御反应的标志基因[7]。番茄PR-1蛋白的C末端鉴定到的一个被创伤和茉莉酸甲酯强诱导的多肽CAPE1可以激活植物抗性反应，提高番茄对病原菌的抗性响应[8]。真菌CAP蛋白通常参与致病过程，人体病原菌白色念珠菌（）及其同源基因的缺失突变体在动物实验中致病力明显下降[9]；尖镰孢（）CAP家族基因敲除突变体对小鼠的致病力显著降低[10]；可可丛枝病菌（）11个CAP家族基因中多数在病菌侵染可可树的过程中显著上调表达[11]。此外，禾谷镰孢（）CAP家族基因敲除突变体对小麦的致病力显著降低[12]。【本研究切入点】尽管在苹果黑腐皮壳菌全基因组测序[13]病原菌分离和鉴定[14]、病菌侵染的组织细胞学[15]、病害发生和流行规律[16-17]、苹果抗性种质资源筛选[18-20]等方面取得了许多重要进展，但该病菌致病因子鉴定和致病机理解析不够充分。此外，动植物CAP蛋白的功能研究不断深入，然而鲜有关于真菌CAP家族蛋白的鉴定和毒性功能研究。【拟解决的关键问题】基于苹果黑腐皮壳菌全基因组信息，通过生物信息学对其CAP超家族蛋白基因进行鉴定。利用PEG介导的原生质体转化技术获得基因敲除突变体和回补菌株，并通过致病力检测明确该菌CAP家族蛋白的毒性功能。

1 材料与方法

试验于2017年4月至2020年8月在西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室完成。

1.1 材料及试剂

菌株和质粒材料：苹果黑腐皮壳菌野生型菌株（03-8）由西北农林科技大学果树病害病原生物学及综合防治实验室分离并保存；PDL2、PFL2质粒由普渡大学许金荣教授惠赠。植物材料：富士（cvFuji）苹果枝条采自于陕西省宝鸡市扶风县法门镇黄堆村果园。

试剂：RNA提取试剂盒（华越洋）、反转录试剂盒（Thermo）、Phanta® Super Fidelity DNA Polymerase（Vazyme）、限制性内切酶（Thermo）、Clone Express®Entry One Step CloningKit（Vazyme）；卡那霉素（Solarbio）、潮霉素B（Roche）、SYBR Green real-time PCR Master Mix（Genestar）、遗传霉素（MP）；核酸Marker DL2000、DL5000（Takara）；DNA凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒（OMEGA）；大肠杆菌感受态DH5（全式金）；崩溃酶（Sigma）和溶壁酶（Sigma）。引物合成及测序由生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析根据CAP超家族蛋白的典型特征，使用BLASTP检索苹果黑腐皮壳菌基因组数据库，并用HMMER 3.0软件（http://hmmer.janelia.org/）筛选具有CAP结构域的氨基酸序列。初筛获得的氨基酸序列输入在线数据库NCBI CDD web server（https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml）分析蛋白结构域特征并进行蛋白功能注释。使用DNAMAN 6.0.3.9对序列比对分析；使用Protein isoelectric point calculator web server（http://isoelectric.ovh.org/index.html）预测蛋白质分子量和等电点；SignalP 4.0在线预测工具（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）预测蛋白信号肽；跨膜结构域的预测使用TMHMM Server v. 2.0（https://services.healthtech.dtu.dk/）在线数据库；糖基化修饰位点使用NetNGlyc 1.0 Server（http://www. cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）在线预测；蛋白泛素化（Ubiquitination）修饰位点的预测使用GPS-SUMO 2.0 Online Service在线软件（http://sumosp.biocuckoo.org/ online.php）。从NCBI数据库中下载苹果黑腐皮壳菌CAP家族蛋白同源序列并使用MEGA 7构建系统发育树。

1.2.2 基因克隆和载体构建使用RNA提取试剂盒（华越洋）提取苹果黑腐皮壳菌总RNA，参照RNA反转录试剂盒（Thermo）说明书合成cDNA。以cDNA为模板，分别使用引物VmPR1a-F/R、VmPR1b-F/R和VmPR1c-F/R扩增目的基因。以Ⅰ和Ⅰ为酶切位点，对pCAMBIA-1302载体进行双酶切并回收和纯化酶切产物，即获得线性化的pCAMBIA-1302载体。使用Clone Express® Entry One Step Cloning Kit（Vazyme）将基因片段连接至线性化的pCAMBIA- 1302载体。采用热激法将连接产物转化至大肠杆菌感受态DH5中，PCR检测阳性克隆并提取质粒送往生工生物工程股份有限公司进行测序，引物序列详见表1。

1.2.3 RT-qPCR分析将粗细均匀的富士苹果枝条剪成10 cm左右的枝段，用0.6%的次氯酸钠溶液浸泡20 min，再用无菌水冲洗3次，枝条表面晾干后用石蜡密封两端。在枝条的中间位置用打孔器（Φ=5 mm）制造接种创口，用相同规格打孔器在野生型菌落边缘按压获得菌饼，随后将单个菌饼接种至枝条创口处，25℃保湿培养。接种病菌0、6、12、24、36、72 h后，采集病健交界部位植物组织，分别提取样品组织RNA并反转录为cDNA。

以不同时间点样品cDNA为模板，使用引物qRT-VmPR1a-F/RqRT-VmPR1b-F/R和qRT-VmPR1c- F/R进行RT-qPCR检测，作为内参基因[21]。RT-qPCR反应条件：95℃ 3 min，95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，40个循环。

1.2.4 基因敲除和回补以野生型菌株03-8基因组DNA为模板，扩增目的基因上游片段和下游片段，以质粒PFL2为模板扩增Neo基因。参考Yu等[22]的方法，使用Double-joint PCR法构建基因敲除盒（图1）。原生质体制备与PEG介导的原生质体转化法参照高静等[23]的方法。分别使用每个基因对应的4对引物（VmPR1-5F/6R、VmPR1-7F/8R、VmPR1-9F/10R和Neo-F/R）对突变体进行PCR检测。以野生型菌株03-8基因组DNA为模板，使用引物PDL2-VmPR1a-F/R和PDL2-VmPR1c-F/R扩增基因并构建基因回补载体。使用潮霉素作为筛选抗生素，利用PEG介导的突变体原生质体转化技术进行基因回补。

表1 本研究所使用的引物信息

小写字母表示同源序列 Lowercases indicate homologous sequences

图1 基因敲除盒构建示意图

1.2.5 营养生长观察用打孔器（Φ=5 mm）在野生型菌株及突变体或回补菌株菌落边缘获取菌饼，将单个菌饼接种至含有10 mL无抗PDA培养基的培养皿中央，25℃避光倒置培养，60 h后观察菌落形态并测量菌落直径。

1.2.6 致病力分析突变体致病力检测参照臧睿等[24]的方法并加以改进，将长度约10 cm、粗细均匀苹果枝条表面消毒后用石蜡密封两端。在枝条中部用打孔器（Φ=5 mm）制造接种创口并分别接种野生型、突变菌株或回补菌株，25℃保湿培养，5 d后观察并测量病斑长度。

1.2.7 数据分析基因的相对表达量采用2-ΔΔCt法计算；数据处理使用Excel 2019软件；数据比较采用测验；柱状图的绘制使用GraphPad Prism软件。

2 结果

2.1 苹果黑腐皮壳菌CAP超家族基因的鉴定

在苹果黑腐皮壳菌中鉴定到3个CAP超家族蛋白基因，分别命名为、和。生物信息学分析发现，CDS序列全长726 bp，编码241个氨基酸，包含4个半胱氨酸，蛋白分子质量为23.67 kD，理论等电点为5.0；CDS序列全长798 bp，编码265个氨基酸，包含1个半胱氨酸，蛋白分子质量为25.07 kD，理论等电点为3.97；CDS序列全长834 bp，编码277个氨基酸，包含6个半胱氨酸，蛋白分子质量为27.18 kD，理论等电点为3.56。利用特异性引物对3个CAP基因进行PCR，成功获得对应长度的DNA片段（图2）。

2.2 进化与特征分析

系统发育分析显示，VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c聚于不同的进化支，VmPR1a聚于clade2进化支并与粗糙链孢霉（）CAP蛋白进化关系较近；VmPR1b聚于clade3且与镰孢菌属（spp.）真菌CAP蛋白的进化关系更近；VmPR1c聚于clade1，也与粗糙链孢霉的CAP蛋白进化关系较近（图3）。

图2 VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c凝胶电泳检测

采用最大似然法构建系统发育树，分支数值代表进化树各分支的支持率

蛋白序列特征分析发现，VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c均有N端信号肽、N端延伸区、CAP保守功能域和C端延伸区（图4），3个CAP蛋白均不含有跨膜结构且注释为未知功能的假定蛋白。CAP蛋白N端信号肽序列的存在暗示VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c可能是苹果黑腐皮壳菌的外泌蛋白。氨基酸活性位点预测发现，VmPR1a存在3个糖基化活性氨基酸位点，VmPR1c存在2个糖基化修饰位点和1个泛素化修饰位点，推测蛋白的功能可能与蛋白修饰有关。

2.3 基因表达量分析

、和在苹果黑腐皮壳菌的侵染早期（6 h和12 h）均上调表达。其中，在病菌侵染6 h和12 h上调表达，并在12 h达到峰值；和均在病菌侵染6 h达到峰值（图5）。以上结果说明，、和可能作为毒性因子参与苹果黑腐皮壳菌的侵染过程。

图4 苹果黑腐皮壳菌CAP超家族蛋白信号肽、保守结构域和活性氨基酸位点预测

*：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001。图8同The same as Fig. 8

2.4 突变体和回补菌株PCR检测

对PEG介导转化获得的转化子进行4对引物PCR检测，最终获得突变体Δ-7和Δ-23，突变体Δ-20和Δ-31以及突变体Δ-26和Δ-40。利用PEG介导的突变体原生质转化法对-7和-20突变体进行基因回补，分别使用引物VmPR1a-5F/6R和VmPR1c-5F/6R 完成PCR检测，最终获得回补菌株/C和/C（图6）。

野生型WT：03-8；Marker：DL2000；1—4：分别指各基因的4对检测引物（5F/6R、7F/8R、9F/10R和Neo-F/R）的PCR产物检测 PCRamplification product detection of 5F/6R, 7F/8R, 9F/10R and Neo-F/R for each gene。A：ΔVmPR1a-7和ΔVmPR1a-23突变体及回补菌株PCR检测 PCR amplification product detection of ΔVmPR1a-7, ΔVmPR1a-23 and complementation strain；引物VmPR1a-5F/6R检测回补菌株ΔVmPR1a/C The complementation strain ΔVmPR1a/C was detected by primer VmPR1a-5F/6R。B：ΔVmPR1b-20和ΔVmPR1b-31突变体PCR检测 PCR amplification product detection of ΔVmPR1b-20 and ΔVmPR1b-31。C：ΔVmPR1c-26和ΔVmPR1c-40突变体及回补菌株PCR检测 PCR amplification product detection of ΔVmPR1c-26, ΔVmPR1c-40 and complementation strain；引物VmPR1c-5F/6R检测回补菌株ΔVmPR1c/C The complementation strain ΔVmPR1c/C was detected by primer VmPR1c-5F/6R

2.5 营养生长观察

、和突变体以及、基因回补菌株在PDA平板上生长60 h后，菌落形态和生长速率与野生型相比无显著差异（图7），说明、和不影响苹果黑腐皮壳菌的营养生长。

2.6 致病力分析

突变体接种离体苹果枝条5 d后，致病力相较于野生型明显减弱，Δ-7和Δ-23致病力分别下降37.7%和39.1%，而基因回补菌株致病力恢复到野生型水平；突变体致病力几乎完全丧失，基因回补菌株致病力恢复到野生型水平；突变体致病力较野生型无显著差异（图8）。结果说明，和是苹果黑腐皮壳菌的毒性因子。

图7 野生型菌株03-8、基因敲除突变体和回补菌株在PDA培养基中菌落形态和菌落直径

3 讨论

蛋白质保守结构域的存在暗示着蛋白可能存在保守生物学功能，植物PR-1蛋白与真菌CAP蛋白具有相似的CAP保守结构域，然而二者功能却差异较大。在已报道的研究中，番茄PR-1蛋白C末端编码的多肽（CAPE1）能够正调控植物的抗性反应，提高番茄对病原菌的抗性响应[8]。VmPR1a和VmPR1c与番茄PR-1 蛋白结构相似而功能迥异，因此，VmPR1a和VmPR1c蛋白C端扩展域的功能有待进一步研究。可可丛枝病菌基因组中存在11个CAP 超家族基因，其中5个在病菌侵染可可树的过程中特异性表达[11]，然而未对这些基因的毒性功能进行研究。本研究中，在病菌侵染早期显著上调表达，但不是苹果黑腐皮壳菌的毒性因子，表明真菌CAP超家族基因并不全部作为毒性因子发挥作用。此外，在禾谷镰孢中鉴定到4个CAP家族基因，其中基因敲除突变体对小麦的致病力显著降低，其余3个CAP家族基因的功能未知[12]。因此，真菌CAP超家族基因功能的多样性有待于进一步探究。

图8 VmPR1a、VmPR1b和VmPR1c突变体致病力检测

苹果黑腐皮壳菌毒性因子丰富、致病机制多样。研究表明，多聚半乳糖醛酸酶基因、和果胶裂解酶基因在苹果黑腐皮壳菌侵染过程中发挥作用[25]；转录因子VmVeA和VmVelB可以通过调控果胶酶表达参与病菌致病[26]；转录组和降解组分析发现，多个milRNA参与苹果黑腐皮壳菌的适应性调节和侵染过程，其中-milR16通过调节蔗糖非发酵1（）、4，5-多巴雌二醇双加氧酶基因（）和一种假设蛋白（）参与致病过程[27-28]。效应蛋白作为病原菌分泌的一类小分子蛋白，能干扰植物生理和生化过程、显著影响植物免疫反应，进而帮助病原菌成功侵染[29-30]。苹果黑腐皮壳菌基因组中鉴定到多个能够抑制BAX引起的坏死反应的外泌蛋白，其中、被鉴定为苹果黑腐皮壳菌的毒性基因[31-33]。

本研究从苹果黑腐皮壳菌中鉴定到3个CAP超家族蛋白基因并且均具有N端信号肽，这些蛋白可能被病原菌分泌并发挥作用。此外，VmPR1a和VmPR1c存在多个活性氨基酸，这些活性氨基酸在其他真菌CAP蛋白中未被关注和研究，暗示苹果黑腐皮壳菌CAP家族蛋白的功能可能与蛋白修饰有关。在今后的工作中将对VmPR1a和VmPR1c蛋白的外泌功能以及能否干扰寄主免疫反应等问题开展探究。

4 结论

在苹果黑腐皮壳菌基因组中鉴定到3个CAP超家族蛋白基因（、和）。毒性功能分析发现，不参与苹果黑腐皮壳菌的致病过程，而和是苹果黑腐皮壳菌重要的毒性因子。

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Identification and virulence analysis of CAP superfamily genes in

WANG ChengLi, YIN ZhiYuan, NIE JiaJun, LIN YongHui, HUANG LiLi

College of Plant Protection, Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling 712100, Shaanxi

【】CAP (Cysteine-rich secretory protein, Antigen 5 and Pathogenesis related protein 1) superfamilyproteins widely exist in fungi, bacteria, animal and plant. This kind of proteins participates in the pathogenic process of the pathogen. The purpose of this study was to identify the CAP superfamily genes inand clarify their virulence roles.【】BLASTP was used to retrieve genes with the conserved CAP domains in the whole genome of. PCR amplification and gel electrophoresis detection were carried out with specific primers. Bioinformatics software and online databases were used for protein sequence characterization and phylogenetic analysis. RT-qPCR was used to analyze the gene expression profiles. Double-joint PCR was used to construct gene knocking-out cassettes, PEG-mediated protoplast transformation was used to obtain knocking-out mutants and complementation strains. To obtain gene knockout mutants, geneticin (G418) was used as a selection marker, and transformants were validated by four pairs of primers. To obtain gene complementation transformants, hygromycin (HPH) was used as a selection marker. The vegetative growth of these strains was determined by cultivation on PDA medium, and the virulence of these strains was verified by inoculation on apple twigs.【】Three CAP superfamily genes were identified in,named,and, respectively. The three CAP proteins all contain four conserved regions, including a N-terminal signal peptide, a N-terminal extension region (NTE), a CAP domain and a C-terminal extension region (CTE). Phylogenetic analysis showed that the three proteins belonged to different clades. VmPR1awas clustered in clade2 and closely related toCAP protein. VmPR1bwas clustered in clade3 and closely related to CAP proteins ofspp.VmPR1cwas clustered in clade1 and also closely related toCAP protein. RT-qPCR analysis showed that,andwere significantly up-regulated during early stages of infection (6 h and 12 h).,b andknockout mutants (Δ-7/23, Δ-20/31 and Δ-26/40, respectively) were obtained, and all mutants showed no apparent alteration in filamentous growth compared with that of the wild-type strain. The virulence of Δ-20/31 was not obviously influenced. However, the virulence of Δ-7/23 and Δ-26/40 was significantly reduced compared with that of the wild-type strain. Moreover, the virulence of gene complementation strains (C andC) was restored to comparable level as that of the wild-type. 【】Three CAP super-family genes were identified in(,and), andandare virulence factors of.

; CAP protein; gene identification; gene knockout; virulence