曹芹芹，岳 珂，林露茜，徐婷婷，张朝栋，郑晶晶，孔安安，仝宗喜，黄淑成

（河南农业大学动物医学院，河南 郑州 450002）

福美双是一种在农业生产上广泛使用的杀菌剂。研究表明，福美双在饲料中的残留会对家禽的生长发育造成不良影响， 尤其对骨骼发育的影响较为严重，可导致骨骼畸形或骨骼虚弱，引起家禽不同程度的跛行，严重威胁动物福利，给家禽养殖业造成极大的经济损失［1-2］。

巴戟天多糖 （Morinda officinalis polysaccharide，MOP）是中药巴戟天的主要活性成分之一，具有补肾阳、强壮骨骼、抗炎、镇痛、抗氧化等多种功效［3-6］。赖满香等［7］研究表明MOP 能提高碱性磷酸酶的活性并促进骨骼矿化， 从而促进成骨细胞的分化。 鉴于MOP 对动物骨骼生长发育的作用，其在预防和治疗肉鸡骨骼生长发育疾病方面具有一定的潜力。

该试验以艾拔益加肉鸡（AA 肉鸡）为研究对象，采用股骨形态与指数评估、股骨灰分检测、生化指标检测等方法， 通过考查股骨的强度和骨量以及钙磷沉积代谢水平， 探究福美双对肉鸡骨骼生长发育的影响，并评价MOP 对由福美双诱导的肉鸡骨骼生长发育不良的保护效果， 为生产实践中预防和治疗由福美双引起的禽类骨骼生长发育不良提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验所用300 只1 日龄AA 肉鸡购于河南省开封市兴达禽业有限责任公司。

1.2 药品、试剂及主要仪器设备

MOP（批号：CY180812），购自杨凌慈缘生物技术有限公司；福美双（二硫化四甲基秋兰姆），购于上海麦克林生物化学有限公司； 钙测试盒 （货号：C004-2-1）、无机磷测试盒（货号：C006-1-1），购自南京建成生物工程研究所； 研钵、 分光光度计、坩埚、电炉、数显式肌肉嫩度仪。

1.3 试验分组及处理

将300 只AA 肉鸡随机分为5 组，包括：对照组，饲喂正常日粮；福美双组，饲喂正常日粮+日粮中添加50 mg/kg 福美双；低剂量MOP 组，饲喂正常日粮+日粮中添加50 mg/kg 福美双+饮水中添加250 mg/L MOP；中剂量MOP 组，饲喂正常日粮+日粮中添加50 mg/kg 福美双+饮水中添加500 mg/L MOP；高剂量MOP 组，饲喂正常日粮+日粮中添加50 mg/kg 福美双+饮水中添加1 000 mg/L MOP，每组3 个重复，每个重复20 只鸡，试验周期为15 d。在试验第4～7 天，福美双组和3 个MOP 组饲料中添加福美双；3 个MOP 组试验全程 （第0～15 天）在饮水中添加MOP。

1.4 肉鸡饲养管理

采用单笼立式饲养，鸡笼规格为60 cm×50 cm×50 cm；试验第1～2 天温度保持在32～35 ℃，之后每周下降2～3 ℃；试验第1～3 天，每天光照24 h，便于雏鸡采食和饮水，之后每天光照14 h；保持适宜湿度和通风，自由采食和饮水。

1.5 检测指标及方法

1.5.1 肉鸡临床表现及股骨形态学的观察 观察各组肉鸡临床表现并拍照记录。 在试验第7、11、15 天进行样品采集， 每组分别选取10 只体重接近平均值的肉鸡进行屠宰取样， 所有试验用肉鸡采取颈椎错位的方式处死， 然后立即取下肉鸡大腿，对股骨的纵向肌群进行剥离，暴露出没有肌肉和脂肪附着的股骨，拍照对比。

1.5.2 股骨剪切力的测定 使用剪切力仪测定股骨剪切力，每个样品重复3 次，取平均值。

1.5.3 股骨物理指标的测定 暴露股骨后使用游标卡尺测量股骨长度， 使用电子天平称取股骨重量，利用阿基米德原理测定股骨密度和股骨体积。

1.5.4 股骨干物质、 钙磷含量和灰分的测定 分别于试验第7、11、15 天进行股骨样品采集。 用生理盐水冲洗干净股骨骨髓腔，用剪刀、镊子把股骨剪碎放于研钵中，置105 ℃烘干箱烘干至恒重，记录股骨干重，并计算干物质含量［干物质（%）=干重/鲜重×100%］。 之后，将股骨研磨成粉末状在电炉上碳化至无烟，再将其放于马弗炉（SX2）灰化［8］，用乙二胺四乙酸铵钠（EDTA）络合滴定法和钒钼黄比色法测定股骨钙（Ca）和磷（P）的含量［9］。通过以下公式计算灰分及灰分密度［10］： 灰分（DM）（%）=灰分重/干物质×100%；灰分（FM）（%）=灰分重/湿基×100%；灰分密度（asd）=灰分重/体积。

1.5.5 血浆钙离子和无机磷含量的测定 于试验第7、11、15 天进行样品采集，抗凝管静脉取血，3 500 r/min 离心15 min， 将血浆分装于1.5 mL 离心管并于-20 ℃冰箱中保存。 分别以微板法、磷钼酸法测定血浆中钙离子含量和无机磷含量。

1.6 数据处理

试验数据采用SPSS 17.0 统计学软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），组间出现显著差异（P＜0.05）时，用Duncan 氏法进行多重比较，P＜0.05 表示差异显著。 试验数据以“平均值±标准误”的形式表示。

2 结果与分析

2.1 肉鸡股骨临床解剖情况

对照组肉鸡形态正常，能够正常行走站立，骨骼发育正常无畸变（见图1a、图1b）；发病组肉鸡常卧于笼内，不能正常行走，跛行，严重者无法站立，骨骼发育异常（见图1c、图1d）。 将试验第7 天不同处理组的股骨进行临床解剖， 拍照对比结果见图1e。 由图1e 可知，对照组肉鸡的股骨长于其他组，说明福美双处理后肉鸡的股骨变形，股骨生长受到抑制。

图1 试验第7 天不同处理组肉鸡临床表现及股骨解剖图

2.2 福美双及MOP 对肉鸡股骨剪切力的影响

在解剖过程中发现， 经过福美双处理的肉鸡股骨与正常肉鸡相比更容易断裂，因此，认为股骨可能受到了福美双毒性的损伤，导致强度减弱。通过测定试验第7 天各组肉鸡的股骨剪切力发现，福美双组肉鸡的股骨剪切力与对照组相比显著（P<0.05）降低；与福美双组相比，不同剂量MOP组的股骨剪切力差异不显著（P>0.05）（见图2）。

图2 各组肉鸡股骨剪切力的测定及比较结果

2.3 福美双及MOP 对肉鸡股骨物理指标的影响

为了解福美双对肉鸡股骨指数的影响以及MOP 对福美双诱导的股骨发育不良的保护效果，该试验测定并比较了各组肉鸡的股骨重量、长度、体积、密度，结果见图3。 由图3 可知，在整个试验阶段，福美双组的股骨重量显著（P<0.05）低于对照组； 除试验第11 天低剂量MOP 组的股骨重量显著（P<0.05）高于福美双组外，福美双组和不同剂量MOP 组的股骨重量差异均不显著（P>0.05）。

图3 各组肉鸡股骨物理指标的测定及比较结果

测量股骨长度发现，与对照组相比，试验第7天福美双组和低剂量MOP 组的股骨长度显著（P<0.05）降低，中剂量MOP 组和高剂量MOP 组的股骨长度变化不显著（P>0.05）；试验第11 天福美双组和不同剂量MOP 组的股骨长度都显著 （P<0.05） 降低； 试验第15 天福美双组和不同剂量MOP 组的股骨长度显著（P<0.05）降低，而低剂量MOP 组和中剂量MOP 组的股骨长度显著 （P<0.05）大于福美双组。

股骨体积测定结果显示， 试验第7 天福美双组的股骨体积显著（P<0.05）低于对照组，而不同剂量MOP 组与福美双组的股骨体积差异均不显著（P>0.05）；试验第11 天福美双组的股骨体积显著（P<0.05）低于对照组和低剂量MOP 组，而中剂量MOP 组和高剂量MOP 组的股骨体积与福美双组相比差异不显著（P>0.05）；试验第15 天各组股骨体积均无显著（P>0.05）差异。

股骨密度测定结果显示， 试验第7 天福美双组的股骨密度显著（P<0.05）低于对照组，此外，福美双组的股骨密度与不同剂量MOP 组相比差异均不显著（P>0.05）；试验第11 天和第15 天各组股骨密度均无显著（P>0.05）差异。

2.4 福美双及MOP 对肉鸡股骨干物质含量、灰分及钙磷含量的影响

由表1 可知，股骨干物质含量检测结果显示：试验第7 天福美双组的股骨干物质含量与对照组相比无显著（P>0.05）差异，而中剂量MOP 组的股骨干物质含量与福美双组和对照组相比显著（P<0.05）减少；试验第11 天福美双组的股骨干物质含量显著（P<0.05）低于对照组，高剂量MOP 组与福美双组相比股骨干物质含量显著 （P<0.05）增加；试验第15 天各组股骨干物质无显著（P>0.05）差异。

表1 各组肉鸡股骨干物质含量、灰分与钙磷含量的测定及比较结果

股骨灰分检测结果显示： 试验第7 天各组的股骨灰分（FM）无显著（P>0.05）差异，福美双组的股骨灰分（DM）与对照组相比变化不显著（P>0.05），低剂量MOP 组与中剂量MOP 组的股骨灰分（DM）显著（P<0.05）低于对照组，但与福美双组相比差异不显著（P>0.05）；试验第11 天福美双组和不同剂量MOP 组的股骨灰分（FM）显著（P<0.05）低于对照组，福美双组的股骨灰分（DM）与对照组相比变化不显著（P>0.05）；试验第15 天福美双组的股骨灰分（FM）与灰分（DM）与对照组相比无显著（P>0.05）变化，高剂量MOP 组的股骨灰分（FM）和低剂量MOP 组的股骨灰分（DM）显著（P<0.05）低于对照组。

股骨灰分密度测定结果显示： 试验第7 天福美双组的股骨灰分密度与对照组相比无显著（P>0.05）变化，中剂量MOP 组的股骨灰分密度显著（P<0.05）低于对照组；试验第11 天福美双组和不同剂量MOP 组的股骨灰分密度与对照组相比均显著（P<0.05）减少；试验第15 天各组股骨灰分密度无显著（P>0.05）差异。

股骨钙磷含量测定结果显示： 试验第7 天福美双组和高剂量MOP 组的股骨钙含量显著 （P<0.05）低于对照组，低剂量MOP 组和中剂量MOP组的股骨钙含量与对照组和福美双组相比差异不显著（P>0.05），各组磷含量均无显著（P>0.05）差异；试验第11 天福美双组的股骨钙磷含量与对照组相比无显著（P>0.05）差异，中剂量MOP 组和高剂量MOP 组的股骨磷含量显著（P<0.05）低于对照组和福美双组；试验第15 天福美双组和不同剂量MOP 组的股骨钙磷含量与对照组相比均无显著（P>0.05）差异。

2.5 福美双及MOP 对肉鸡血浆钙离子和无机磷含量的影响

由图4Ⅰ可知，在整个试验期间，各组肉鸡的血浆钙离子含量无显著（P>0.05）差异，但试验第7天低剂量MOP 组和中剂量MOP 组的血浆钙离子含量与对照组和福美双组相比有所提高， 并且第11 天不同剂量MOP 组的血浆钙离子含量与对照组相比均有不同程度的提高。

由图4Ⅱ可知，试验第7 天和第11 天各组肉鸡的血浆无机磷含量无显著（P>0.05）差异，但试验第7 天福美双组的血浆无机磷含量低于对照组，同时，不同剂量MOP 组的血浆无机磷含量显示出高于对照组的趋势； 试验第15 天中剂量MOP 组的血浆无机磷含量与对照组相比显著（P<0.05）升高。

图4 各组肉鸡血浆钙离子和无机磷含量的测定及分析结果

3 讨论

福美双是一种广谱杀菌剂，在我国农业生产中应用广泛。 研究表明，福美双能诱发家禽腿病［11］。该研究结果表明，在日粮中添加福美双后，肉鸡出现明显的运动减少、 跛行甚至不能直立行走的现象，说明福美双可诱发肉鸡腿病，这与Rath 等［12］的研究结果一致。

骨骼在脊椎动物中起到运动、 支持和保护机体的功能， 也是制造红细胞和白细胞以及储藏矿物质的部位［13］。 之前关于福美双的研究主要集中在其诱导肉鸡发生胫骨软骨发育不良， 进而研究其发病机制［14］。 该研究在福美双对肉鸡的暴露过程中发现，健康肉鸡经过福美双处理，股骨的生长发育受到不同程度的影响。

在该试验收集肉鸡股骨样本的过程中， 发现经过福美双处理后股骨剥离时更容易断裂， 进一步测定股骨的剪切力显示， 福美双组股骨剪切力显著（P<0.05）低于对照组，说明福美双毒性会造成股骨强度降低， 进而导致骨骼畸变和骨折风险增大。 MOP 能够促进成骨细胞分化，对骨骼发育具有保护作用［15］。该试验结果显示，在给予不同剂量MOP 后， 肉鸡的股骨剪切力有不同的变化，高剂量MOP 组的股骨剪切力与对照组接近，说明高剂量的MOP 对福美双诱导的股骨损伤具有一定的积极作用，能够减轻股骨损伤，从而起到一定的治疗效果。

此外， 临床解剖结果显示对照组股骨发育优于福美双组。 为了进一步研究福美双毒性对股骨的影响，该试验测定了股骨的物理指标，如股骨长度、重量、密度等，用来比较各组肉鸡的股骨发育情况。 家禽育成期内腿骨重量和长度的绝对生长值与其体高和体重存在密切关系，其中，长骨的发育程度对鸡只的体高又起着决定性作用。 在生长阶段各组织与器官的良好发育， 以及产生合理的躯体结构对生产性能潜力的发挥都会产生直接影响［16］。 该研究结果表明，日粮中添加福美双后，肉鸡的股骨长度、重量、体积都明显低于健康肉鸡，说明福美双能降低股骨的长度、 抑制股骨重量的增长，从而进一步抑制肉鸡身高体重的增长，这会导致肉鸡体型小、生长发育慢。骨密度全称是骨骼矿物质密度，是衡量骨骼强度的一个重要指标［17］，骨密度过低会导致骨质疏松和骨折风险增加。 该研究结果表明，日粮中添加福美双后，肉鸡的股骨密度明显降低，而在低剂量MOP 的作用下，股骨密度有一定程度的回升。结合股骨剪切力结果提示，福美双对肉鸡股骨强度造成明显损伤， 使股骨脆性增加，强度降低，容易断裂，从而引起腿病。 而MOP 对福美双毒性具有一定的拮抗作用， 能够改善股骨密度，有利于股骨生长发育，减少腿病发生。

骨骼中灰分以及钙和磷含量等是衡量骨骼质量的重要评价指标［18-19］。 灰分是指某种物质在高温时，发生一系列物理和化学变化，最后有机成分挥发、逸散，残留下来的无机物。灰分含量越高，骨骼中所含的无机矿物质含量越高，骨骼密度越高，骨骼抗压能力越强［20］。该研究结果显示，在试验第11 天福美双组的股骨干物质含量及灰分（FM）显著（P<0.05）低于对照组；而在其他发育时间段，福美双组的股骨干物质含量及灰分（FM）和灰分（DM）呈不显著（P>0.05）变化，但有降低的趋势，而不同剂量MOP 组有一定的升高。 由此可知，福美双会引起肉鸡股骨干物质含量和灰分降低。 骨骼的抗压程度和坚硬度依赖矿物基质的主要成分羟基磷灰石，而钙盐构成了骨架的主要无机部分，是羟基磷灰石晶体的主要组成部分［21］。 骨矿化是指钙磷等无机盐在骨组织中的沉积过程。该研究结果表明，福美双暴露组肉鸡的股骨钙含量显著（P<0.05）低于健康肉鸡，磷含量变化不显著（P>0.05）；肉鸡摄入MOP 后，股骨钙的含量有一定程度的增加。 这说明福美双毒性会减少股骨钙沉积， 从而影响股骨发育，而MOP 能够促进骨钙沉积，从而改善福美双造成的股骨损伤；另外，研究发现骨钙与骨磷相比对福美双暴露更为敏感， 故推测福美双发挥其毒性作用主要与骨钙代谢有关。

除了骨骼钙磷含量， 血浆中的钙磷离子含量也能反映机体的钙磷代谢功能［22］。 血浆钙磷离子含量与动物的骨骼代谢密切相关， 血液中的钙能转移到骨骼中形成钙盐， 为新骨的形成提供必要条件［23］。正常情况下，机体内血浆钙磷离子含量是稳定的，但在机体钙磷离子代谢发生明显异常时，血浆钙磷离子含量会升高或降低［24］。 该研究结果表明， 福美双在肉鸡发育早期会使血浆钙磷离子含量减少，而添加MOP 后血浆钙磷水平表现出升高趋势， 说明福美双暴露可能会在肉鸡发育早期影响血浆钙磷水平。因此，推测福美双可能通过扰乱钙磷代谢平衡影响股骨发育，而MOP 能够对该种代谢紊乱起到一定程度的改善作用。

4 结论

福美双通过抑制肉鸡股骨生长发育， 降低股骨强度和钙磷沉积， 进而对股骨生长发育产生毒性作用，致使股骨出现损伤，而MOP 在一定程度上有保护和缓解效果。