史静茹，郭丽丽，刘在霞，刘永斌，张家新，张文广

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.动物遗传育种与繁殖内蒙古自治区重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018；3.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031）

绵羊作为重要的经济动物，遍布世界，皮毛和羊肉为人类提供了生活用品和食物， 绵羊养殖业已经成为畜牧业发展和农牧民增收的重点产业，我国绵羊存栏数趋于世界前列。 绵羊的繁殖性状是一种经济性状，与经济收益息息相关。绵羊的繁殖性状与经济的关系促使学者对绵羊繁殖性状进行更深入的研究与探索。伴随大数据时代的来临，利用高通量测序技术探究复杂的有机体调控网络成为趋势， 最早被研发并应用的转录组测序技术为微阵列技术（microarray technology），该技术较为成熟，花费成本适中、数据分析软件较多。 基因芯片技术是微阵列技术的基础， 此技术只可检测已知基因序列，不能检测未知的基因序列。基因芯片技术灵敏度低并缺乏广泛性， 使用该方法检测丰度较低的序列和重复序列有一定难度， 异常转录产物也很难被检测到。相比基因芯片技术，基因表达系列分析技术（serial analysis of gene expression，SAGE）无需依托基因序列信息，却可以获得所有基因的表达量。SAGE 技术不仅能够显示差异基因表达谱， 还可以探索低丰度基因和未知基因。SAGE 技术优化后的大规模平行测序技术（massively parallel signatur sequencing，MPSS）， 测序步骤被简化，但测序精确性有所提高。这两项技术都是建立在费用较高的Sanger 测序基础上， 测序工作量大是操作过程中存在的问题，没有被推广。与上述几种方法相比， 转录组技术可以直接测定每个转录本片段序列，精确性高，单个碱基的差异也可被检测。转录组技术无需特异性探针，不需要明确的物种基因信息，即可对任意物种直接进行转录组分析，对研究除模式化生物外的其他生物具有极大意义。 尽管有高通量测序技术支持，哺乳动物的生殖调控依然是养殖领域研究需要突破的难关， 绵羊的繁殖调控一直是研究者的重点关注方向［1］。

能否成功受胎并妊娠维持是影响经济效益关键的因素。 绵羊卵子的发生与发育信号通路现在已经被生物信息学技术挖掘出来， 需要进一步探究其生理机制与遗传特性。研究表明，大多数多胎绵羊品种的繁殖性状受到单基因主基因或多基因效应的调控［2-3］。 此外，挖掘出大量与产羔、排卵和发情有关的基因，这些基因有GDF9、BMP15、BMPR1B、B4GALNT2、ESR1、ESR2、PGR、SMAD1、CYP11A1［4-5］。我国著名的地方多胎羊品种是小尾寒羊， 该品种具有四季发情的特点。 通过研究小尾寒羊卵泡期和黄体期各基因表达水平，发现TGF-β 信号通路中SMAD1、SMAD4、TGFβRⅡ和FSTL3 基因与小尾寒羊四季发情有关［6］。 研究绵羊卵巢营养因素引起的季节性发情，发现PLA2G4D 基因直接影响卵泡发育，间接影响瘦素分泌［7］。

国内外研究人员通过转录组学研究已经挖掘出大量的羊繁殖相关基因， 但是对维持妊娠的基因发掘较少，在母畜妊娠时期，需要母体和胎盘激素的协同调控，孕激素和雌激素的作用至关重要［8-9］。目前， 以孕激素和雌激素作为妊娠诊断依据的标准不统一，关于绵羊妊娠转录组学的研究鲜有报道。妊娠期间内分泌系统也发生变化， 妊娠黄体不可缺少。若受精卵发育正常，保证维持妊娠，周期黄体在卵巢中能够转化成妊娠黄体，分泌孕酮［10-11］。 该研究对绵羊不同妊娠时期卵巢转录组数据进行分析，获得差异表达基因，探究与妊娠维持相关的重要基因。

1 材料与方法

1.1 样本数据来源

从NCBI 的高通量测序数据SRA 存储库下载3 个妊娠时期绵羊卵巢组织转录组的18 个样本数据［12］。试验绵羊均为苏格兰黑面羊和特克赛尔羊F1代杂交品种，3 个妊娠时间分别为妊娠23 d、妊娠35 d 和妊娠100 d， 每个妊娠时间有6 个技术重复样本。

1.2 数据处理及分析

使用Z-Score 方法， 对转录组数据进行标准化处理。 将妊娠23 d、妊娠35 d 的绵羊卵巢组织基因进行比较，妊娠35 d、妊娠100 d 的绵羊卵巢组织基因进行比较。使用R 语言的limma包进行差异分析， 筛选差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）， 以P-Value<0.05和|logFC|≥2 作为筛选DEGs 的条件［13］。利用DAVID在线软件对DEGs 注释及功能富集分析， 并以PValue<0.05 作为信号通路显著富集的标志［14］。

2 结果

2.1 差异表达基因的筛选

在妊娠23 d、妊娠35 d 绵羊卵巢组织基因中筛选出54 个DEGs，在妊娠35 d、妊娠100 d 绵羊卵巢组织基因中筛选出68 个DEGs， 两组均包含HSP90AA1、HSP90AB1、MMP2 和HSP90B1 基因。

2.2 差异表达基因功能富集分析

妊娠23 d 与妊娠35 d 绵羊卵巢组织基因的54 个DEGs 显 著 富 集 到6 条 通 路 （P-Value<0.05）， 包括内质网蛋白质加工信号通路（protein processing in endoplasmic reticulum）、 核糖体信号通路（ribosome）、雌激素信号通路（estrogen signaling pathway）、 癌症蛋白聚糖信号通路（proteoglycans in cancer）、 扩张型心肌病信号通路（dilated cardiomyopathy）和肥厚型心肌病信号通路（hypertrophic cardiomyopathy）（见图1）。

图1 妊娠23 d 与妊娠35 d 绵羊卵巢DEGs 显著富集的KEGG 通路

妊娠35 d、 妊娠100 d 绵羊卵巢的68 个DEGs 显著富集到11 条通路 （P-Value<0.05），包括癌症相关信号通路（pathways in cancer）、黏着斑信号通路（focal adhesion）、抗原加工与提呈信号通路（antigen processing and presentation）、细胞外基质受体相互作用信号通路 （ECM-receptor interaction）、细菌侵袭上皮细胞信号通路（bacterial invasion of epithelial cells）、 内质网蛋白质加工信号通路、核糖体信号通路、雌激素信号通路、PI3K-Akt信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）、癌症蛋白聚糖信号通路和前列腺癌信号通路（prostate cancer）（见图2）。

图2 妊娠35 d 与妊娠100 d 绵羊卵巢DEGs 显著富集的KEGG 通路

3 讨论

随着人们生活水平的提高， 对绵羊产肉的品质及所含的营养成分有更高要求，因此，在保证绵羊肉品质的同时， 提高绵羊繁殖能力才能满足市场的需求。

该研究对绵羊不同妊娠时期卵巢转录组分析， 发现不同妊娠时期的卵巢筛选出的DEGs 均富集到雌激素信号通路。 雌激素是由卵巢和胎盘分泌的一种重要生殖激素，对动物发情、分娩等生殖功能起着重要作用［15］。 在雌激素信号通路中包括HSP90AA1、HSP90AB1、MMP2 和HSP90B1 基因。有研究表明糖皮质激素受体（GR）NR3C1 及其共同伴侣HSP90AA1 存在差异甲基化， 可能在妊娠期应激反应中起调节作用， 可能是子痫前期的一 个 生 理 病 理 机 制［16-18］。 Nikishin 等［19］研 究 表 明HSP90AB1 基因可作为卵巢组织的参考基因［20］。在妊娠过程中，子宫的状态一直在变化。正常妊娠期间的血管舒张， 胎盘形成和子宫扩张会引起MMP2表达增加。在妊娠期间，各种分子参与着床和维持子宫内膜功能。 MMP2 在子宫内膜基质重塑这一协调妊娠进程的必要过程中起着重要作用［21］。 细胞外基质成分可以被MMP2 降解， 在排卵和妊娠过程中具有重要作用， 能够促进细胞迁移和血管生成［22］。 MMP2 基因启动子存在单核苷酸多态性，有研究表明MMP2-735T 等位基因与反复自然流产风险显著相关［23-24］。 Gremlich 等［25］表明胎儿MMP2-1306 与宫内生长迟缓风险增加相关。 研究表明PRL8A2 是孕激素调节宫内对生理性应激反应的媒介，PRL8A2 缺失会使HSP90B1 的表达显著升高，引起内质网应激反应增强［26］。

4 结论

通过对不同妊娠时期卵巢转录组比较分析，发现在妊娠期间雌激素信号通路上的基因表达有着很大差异， 包括HSP90AA1、HSP90AB1、MMP2和HSP90B1 基因，这些基因可能对绵羊妊娠维持有着重要的作用。