张春华，张崇志，金 鹿，桑 丹，李胜利，王泽平，刘要仙，乌龙都特，孟根曹，孙海洲

（1.内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；2.伊金霍洛旗农牧技术推广中心，内蒙古 伊金霍洛旗017200；3.伊金霍洛旗农牧业综合行政执法大队，内蒙古 伊金霍洛旗 017200；4.乌审旗家畜改良工作站，内蒙古 乌审旗 017300）

最初， 人们猜想生物钟可能是动物机体对白天和黑夜变化的反应，即白天行动，晚上休息。 后来，试验证明，生命体在没有任何环境变化的条件下仍然表现出以24 h 为周期的节律行为。 生物钟系统使生命体自身的节律与外界环境的节律同步化，不仅能够优化生物体的日常行为节律，还参与了生命体大多数的生理过程。自18 世纪科学家们报道生命体存在近似24 h 的昼夜节律以来，在果蝇［1］、斑马鱼［2］、小鼠［3］、肉鸡［4］、山羊［5-6］、绵羊［7］、马［8］、奶 牛［9］和 人［10］等 方 面 开 展 一 系 列 的 研 究 工作， 以揭示生物节律在生命体生理过程中的内在机制。 进入21 世纪以来，生物节律的研究已达到一个新的高度，标志性成果是2017 年美国科学家因发现昼夜节律生物钟的分子机制而获得诺贝尔生理学或医学奖。

1 生物钟的构成及作用机制

1.1 昼夜节律的构成

生物体的生理反应都遵循着以24 h 为周期的节律行为，这个周期长度一般对温度不敏感，受到环境自然光的明暗信号的约束， 形成了一种以近似24 h 为周期的振荡器（oscillator），学者们将这种“昼夜节律”称为生物钟（circadian clock）。 生物钟是机体为了适应环境， 在进化过程中自然选择的作用下获得， 而且在根据环境变化调节生理功能和行为中起着重要的作用［11］。 生物钟的组成包括输入途径 （接受并传递外界的刺激至振荡器）、振荡器（启动并产生节律性的振荡器）、输出途径（节律的输出部分）三部分。 振荡器是维持生物节律的关键部分， 生物体内关键基因的表达随昼夜节律呈现规律性的振荡， 导致相关蛋白水平也随昼夜更替有规律地振荡， 通过对下游钟控基因（clock controled gene,CCG）表达的调控，调节众多生理过程。

1.2 生物钟的作用机制

在细胞水平上，这些节律是由能产生振荡基因表达的反馈回路控制，并且与染色质体系结构的昼夜变化、信使RNA 的处理、蛋白活性和蛋白质周转相关［12］。 研究已表明，哺乳类动物表达的生 物 钟 基 因 主 要 有Clock、Period （Per1、Per2、Per3）、Bmal1、Cryptochrome（Cry1、Cry2）等［13］，这些节律性基因构成了生物体内相对保守的昼夜振荡的自身调控反馈回路。 节律基因由昼夜振荡正负反馈回路组成：①转录—翻译反馈回路的正性成分， 开启节律基因并使之表达。 Clock 和Bmal1 是重要的生物钟基因，Bmal1 基因高表达通过转录因子bHLH-PAS 能够激活Clock， 促进核心转录因子BMALI 与CLOCK 形成BMALICLOCK 异二聚体。 作为正性成分调节因子，BMALI-CLOCK 异二聚体能够结合其他节律基因及节律控制基因的启动子区相关元件， 以激活Period （Per1、Per2、Per3）、Cryptochrome （Cry1、Cry2）和Rev-Erbα 等基因的转录［14］。 ②转录翻译后负性成分阻止正性成分表达。Per 基因经转录、翻译的PER 蛋白积累在胞浆中并逐步被CKIε磷酸化而降解。 随着时间的推移，CRY 蛋白在胞浆中积累并形成稳定的CKIε/PER/CRY 聚合物。进入细胞核CKIε/PER/CRY 的CRY1 能够扰乱BMALI-CLOCK 聚 合 物 转 录 复 合 物［15］，从 而 抑制其他节律基因及节律控制基因的转录，并呈现出Clock 和Bmal1 核心生物钟的负反馈环路调节［16］。 然而，Dbp、E4bp4 等节律控制基因在动物体生物钟回路、激素合成以及神经信号传递等方面发挥着重要的作用。 ③Rev-Erbα 蛋白进入核内后抑制正调节端Bmall 基因的转录且表达水平下调，而负调节端Cry 基因阻止Rev-Erbα 基因转录，因此Rev-Erbα 基因成为连接正负调节的中调因子， 形成了节律性基因昼夜振荡的嵌套回 路［14］。

2 生物钟的生理功能

哺乳动物的生物钟基因最早发现于下丘脑视交叉上核（suprachiasmatic nueleus，SCN），基本的运作模式是：生物钟基因的转录和翻译、生物钟蛋白的生成、构成自动调节的反馈回路。 随着后来研究的不断深入，学者们发现生物钟基因不仅在中枢神经系统表达，在皮肤毛囊［6］、肝脏［17］、肾脏［18］、心脏［19］、肌肉［20］、脂肪［21］、生殖器官［22］等组 织中也 有表达。SCN 必须周期性地调整外周生物钟,以防止肝脏、心脏、肾脏等外周组织中生物钟基因表达量的减少, 但是SCN 对外周组织中生物钟的调控机制目前还不清楚［23］。更多的研究结果表明，生物钟基因在调节毛发生长系统、 内分泌系统、 免疫系统、生殖系统等方面发挥着重要的作用。

2.1 毛发生长系统

动物毛发生长的昼夜节律在研究中普遍被发现，动物毛发循环生长受到生物钟基因的调控［15］。在Clock 和Bmal1 基因敲除的小鼠研究中， 发现毛囊的生长期被显著推迟， 生物钟基因Clock 和Bmal1 能够调节毛囊细胞周期的活动［15，24］。 Clock和Bmal1 基因敲除的小鼠， 毛囊发育被阻止在生长早期，Clock 基因在次级毛囊的休止期和生长早期高度表达， 生物钟基因控制着毛囊的整个发育过程［25］。 生物钟基因在皮肤毛囊中的表达呈现出昼夜的变化，Cry1 和Cry2 基因敲除后， 小鼠的生物钟缺失， 同时Per 基因在调控皮肤毛囊的发育中也发挥重要的作用。 Tanioka 等［26］发现皮肤中有类似其他外周器官的固有的昼夜节律的振荡周期，生物钟基因在皮肤毛囊中有表达，而且发现小鼠皮肤毛囊发育周期性变化过程受生物钟基因的调控。生物钟基因（Bmal1、Clock、Cry1）伴随辽宁绒山羊次级毛囊周期循环过程出现周期性的表达变化［5］。 动物皮肤中的所有细胞类型存在生物钟基因的表达， 而且生物钟主要的基因表达在次级毛囊的休止期和生长早期。 动物毛发的生长周期依赖生物钟基因的表达，在休止期至生长期阶段，生物钟基因量呈现高表达［15］。

2.2 内分泌系统

生物钟在调节内分泌系统中起着重要的作用，同样，内分泌系统同步调节着生物钟。

2.2.1 糖皮质激素 糖皮质激素（glucocorticoids,GC）属于类固醇激素，在炎症、代谢、心血管及神经系统等方面发挥着多种生理功能， 对维持机体的正常生长发育及内环境的稳定等大多数的生理过程具有重要的调节作用。GC 的广泛生物学效应主要由糖皮质激素受体 （glucocorticoid receptor，GR）介导，它在大多数外周组织中有表达，而在SCN 中没有表达。研究表明，糖皮质激素及其受体信号不仅能够引起机体内生物钟基因的表达量发生显著变化， 还可以引起外周生物钟基因表达时相的移动［27］。 小鼠Per1 基因被敲除后，糖皮质激素表达量增加［28］，Cry1 和Cry2 的表达能够抑制GR 的含量［29］，Cry1 和Cry2 表现出了与“时钟无关”的相互作用，主要是指不涉及BMAL1-CLOCK的相互作用。 研究发现，Cry1 和Cry2 可能与激素反应元件相结合，同时也是GR 的结合位点［30］。 最近的研究表明，CLOCK 与GR 能够直接发生相互作用，并对GR 进行乙酰化，从而通过降低其结合DNA 的能力， 抑制其活性；CRY 也能够通过直接结合GR 而抑制GR 的功能［29］。也有许多研究报道了关于GC 与节律基因的相互作用［31］，Per2 基因在小鼠脑部的表达依赖GC 的节律变化［32］，而且小鼠肾上腺生物钟功能的缺失修改了肝脏中Per1基因的表达［33］，其生物钟基因表达改变的进一步机制未被揭示。

2.2.2 褪黑激素（MEL） MEL 由松果体分泌，含量能够随光周期的变化而改变。 哺乳动物的昼夜节律也是以MEL 夜间分泌持续时间长短变化为中心，MEL 主要通过褪黑激素受体1A （MT1）和2A（MT2）的介导而发挥功能［34］。 MT1 在垂体腺结节部（pars tuberalis，PT）有丰富的表达，所以MEL能直接作用于PT 介导光周期信号。哺乳动物垂体PT 部生物钟基因的表达受到MEL 的调控而呈现节律变化，Cry1 和Per1 可能解码了MEL 分泌的节律信号，PT 细胞作为光周期信号记忆体而扮演分子日历的角色［35］。 在哺乳动物中，2 型脱碘酶（DIO2）和3 型脱碘酶（DIO3）不仅受到MEL 信号的作用影响，而且依赖光周期调控，同时DIO2 和DIO3 也介导了光周期信号对下丘脑局部甲状腺激素（TH）浓度的控制。 动物在长光照时，下丘脑三碘甲状腺原氨酸（T3）浓度的增加依赖DIO2 的增加； 短光照时，DIO2 浓度的下降伴随T3 浓度的降低［36］。 然而，DIO2/DIO3 对TH 的调节机制可能也存在种属的差异， 光周期使动物体基础代谢的改变可能是TH 改变的根本因素。 因此，下丘脑—垂体—MET 系统与生物钟基因既互为依存又相互联系。

MEL 信号能够通过与生物钟核心振荡器的平衡调节维持生命的健康， 机体内源生物钟的功能失调、MEL 受体基因的多态性、年龄以及与疾病相关的MEL 含量的下降很可能是诱发代谢综合征、2 型糖尿病、高血压等疾病的因素。 MEL 对哺乳动物SCN 有很大的影响， 主要表现在人类的生物钟功能方面，涉及MT2 信号的表达。 研究表明，MEL在脂肪组织同步的昼夜节律中的作用已被证明，在离体大鼠脂肪细胞，MEL 能够上调Per1、Cry1 和Bmal1 的mRNA 表达水平， 而且Per2 和Bmal1 的时相关系能够被MEL 调节［37］。 以小鼠为研究模型结果表明，MEL 受体的敲除能够抑制Per 基因的表达，Per 基因的表达被活化的MEL 受体调节，Per1/2 的昼夜节律被扰乱后会干扰MEL 在夜间的分泌［38］。 Gupta 等［39］研 究 了 在 夏 季 和 冬 季 热 带 松 鼠SCN 中MT1、Per1 和Cry1 基因的表达随着血浆中MEL 浓度的24 h 的变化规律，提出MEL 的季节性变化不仅调节了MT1 在SCN 中的表达，而且修改了MT1 的功能， 也通过改变Per/Cry 的表达揭示SCN 分子时钟基因表达谱。

2.3 免疫系统

近年来， 生物钟基因在免疫系统方面的研究成为热点。 核心生物钟基因在小鼠脾脏的巨噬细胞、树突状细胞、B 细胞以及人的淋巴细胞中呈现出振荡性表达。 小鼠的昼夜周期被打乱后会增加它们对炎性疾病易感的概率， 从而证实生物钟影响动物免疫系统。研究表明，机体的生物钟能够通过某一信号通路控制白介素-17 （IL-17） 生成CD4+辅助T 细胞 （TH17）［40］。 Toll 样受体家族的TLR9 （toll-like receptor 9） 是 巨 噬 细 胞 识 别CpGDNA 的模式识别受体，呈现节律性表达，同时错配在Per2 基因突变小鼠的免疫组织中（在整个脾脏中表达上调， 但在脾脏的巨噬细胞中表达下调）。 在调控腹腔巨噬细胞方面，生物钟的siRNA能够降低TLR9 表达。在TLR9 高表达小鼠表现为更好的先天免疫反应。 在脓毒症小鼠模型中，TLR9 表达的高峰期增加败血症的严重程度［41］。研究表明，Clock 基因敲除的小鼠限制了T 细胞抗原反应； 而且小鼠在白天比在夜晚表现出更强的T 细胞免疫反应应答；生物钟E4 启动结合蛋白能够负向调节Dbp 控制基因和正向调节自然杀伤细胞的发育，B 细胞能够转换到免疫球蛋白IgE 和T细胞反应［42］；小鼠有自身的生物节律，这种生物节律被扰乱后，会降低自然杀伤细胞的活性［43］。总之，上述研究提供了一些生物钟基因与免疫应答相互关系。

2.4 生殖系统

生殖生物钟也称生殖生理钟， 学者们在外周生物钟系统的研究中表明，生物钟基因在小鼠、大鼠和牛的卵巢中呈振荡性表达［44］。 研究表明，Bmal1 基因敲除雌性小鼠生育能力下降， 而且延缓了发情期［45］。 Bradshaw 等［46］认为生物钟基因在卵巢中的表达对其发育有重要的意义。 生物钟基因Bmal1、Cry、Per2 在牛卵巢中有表达，且未受到卵泡刺激素的影响， 但Clock 基因与卵泡发育息息相关。 最近的研究发现， 生物钟基因Bmal1、Clock、Cry1/2、Per1/2 在小鼠妊娠后期子宫、胎盘和胎膜等组织中均有表达， 表明生物钟基因与妊娠分娩有关，但其生理意义有待观察［45］。

研究表明， 生物钟基因在精子细胞中呈依赖性表达［22］。 CLOCK 和BMAL1 蛋白被定位于染色体中，而且在雄性生殖细胞中发现了胞浆细胞器，但其中的生理意义还不确定， 然而精子细胞的Bmal1 基因敲除后表现为畸形。 也有研究表明，小鼠被敲除Bmal1 基因纯合子后， 精子活力和受精能力未受到影响，但精子数量显著减少［47］。 Per 基因对昆虫精子释放起着重要的调控作用［48］。 生物钟基因在雌性和雄性生殖系统中被推测为非24 h的独立性生物钟，这也以另一种方式理解超过24 h 的生物钟。 然而，24 h 的周期性循环也独立于生殖系统中。

3 外界条件对生物钟的影响

3.1 光周期对生物钟的影响

光照条件的变化调节生物节律可能的生理途径是： 当光信号直接作用于眼中的光敏感视黄醛神经细胞时， 通过视网膜下丘脑纤维使光信号到达动物体母钟SCN，并作用于松果体，由松果体分泌大量的MEL 以调节动物机体的其他内分泌激素，进而促进心脏、肝脏、肾脏及内分泌系统、生殖系统和免疫系统等外周组织的子钟的生物钟基因的转录调节昼夜节律［49-50］（见图1）。

图1 生物钟调节机体生理代谢的综合作用［50］

研究表明， 光照条件的变化能够显著影响皮肤中Per1、Per2 基因的表达水平［26］（见图2）。 小鼠围产期昼夜节律基因在机体大多数组织中表达，而且随着光周期的改变， 生物钟基因能够通过协调内分泌系统和生理代谢的变化促进泌乳［51］。 以马为研究对象也表明了光周期能够改变毛囊节律基因Cry1、Per1、Per2 等的表达［8］。 以Soay 绵羊肝脏为研究对象， 结果表明光周期也显著影响了肝脏中昼夜节律基因的表达［7］。 光周期能够通过调节生物节律改变奶牛内分泌系统和代谢能力，进而影响奶牛的泌乳性能［51］，其机制可能是通过下丘脑—垂体—内分泌—生物钟途径实现的。 短光照能够促进干奶期奶牛乳腺的生长， 使泌乳期产奶量能够增加3～4 kg/d，而催乳素（PRL）和类胰岛素生长因子-1（IGF-1）含量降低［9］。

尽管每个组织都从中央时钟接收信息以协调其功能， 但每个组织也有能力独立地对光的变化做出反应，并感受白天和夜晚光强度的变化。研究者们比较了小鼠模型中的健康小鼠和中央时钟受损小鼠表皮和肝脏的昼夜节律， 确认这两个组织对随时间推移而发生变化的光照有自主性［52-53］。

3.2 营养水平对生物钟的影响

研究表明，动物肝脏器官的营养代谢途径大部分是由生物钟节律基因控制［54-55］，Bmal1 通过节律性调节肝脏线粒体动力学促进机体代谢健康［56］。食物信号对生物钟（尤其是外周生物钟）的信号调控作用已被大量的实验证实， 不同的饮食习惯和食物的热量差异会影响体内生物钟的信号［57-58］。昼夜节律控制肠胃消化［59］，营养水平、摄食的时间和周期对机体昼夜节律的调节和代谢有显著影响，动物消化器官在夜间的机能下降，基础代谢很低，饮食诱发的产热在早上最高，在晚上最低。 能量水平对肝脏代谢及营养分配重新编程有多方面的影响，通过扰乱生物钟基因BMAL1-CLOCK 和过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR-γ）影响正常的昼夜节律。 研究表明， 小鼠中高脂日粮使PPAR-γ 因子在肝脏中呈现振荡性的表达［17］，在肝脏、肌肉等组织和器官中，许多与代谢相关的基因表达都呈现出明显的昼夜节律性。 这些基因参与脂代谢、胆固醇合成、糖代谢及转运、氧化磷酸化等生理过程的调控。 在动物的生物钟调控通路中，细胞核内激素受体REV-ERB 和ROR 构成了一个反馈回路，调节正调控元件Bmal1 的表达。参与代谢调节的许多重要基因， 其表达也都直接受到生物钟的调节， 如营养传感器基因SIRT1、AMPK，代谢酶基因Alas1、Hmger，代谢关键中间物NAD+，核受体PPAR-γ 等。

4 小结

尽管随着一系列生物钟基因及蛋白的发现和生物钟各个因子运作机制的揭示， 人们对昼夜节律生物钟认识取得了很大进步， 但还存在很多需要探索和研究的未知领域。例如：①生物钟基因之间的协同和拮抗关系如何。 ②生物钟基因与其他调节因子是如何相互作用调节生命活动的。 ③输入信号作用于振荡器及输出信号的分子机制。 ④外周各个组织器官的振荡器是通过哪些方式互相协调的。 ⑤下丘脑视交叉上核对外周组织生物钟是否也有调控的作用，以及如何调控。⑥光周期和营养水平的变化如何影响生物钟以改变动物的生产性能等。生物钟基因生理机制的进一步研究，对揭示生命规律的本质、生物进化的分子基础、生命遗传学等的研究领域具有重要意义， 同时也为人类医学及农牧业生产提供了新的研究思路和理论依据。