王光宇，邱伟芬，徐幸莲，周光宏

（1.南京财经大学食品科学与工程学院，江苏 南京 210023；2.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095）

肉品腐败变质导致了全世界范围大量的食品浪费，了解肉品中常见腐败微生物并探明其致腐机制是有效控制肉品腐败的前提[1]。假单胞菌（Pseudomonasspp.）能够导致有氧储藏条件下肉类的腐败，主要表现在使肉品组织软化、产黏和产生异味[2-4]。其中莓实假单胞菌（P. fragi）是肉品中最常见的假单胞菌，尤其是有氧储藏条件下的冷鲜肉[1]。从屠宰场一直到市场的冷链环境中，该菌均能大量生长并且分泌多种胞外酶[5-7]。目前已有大量文献报道莓实假单胞菌是有氧条件下冷鲜牛肉[8-9]、禽肉[10-11]和海产品[12]中的优势腐败菌，且随着时间的推移，莓实假单胞菌的优势地位更加明显[13-14]。

在本团队前期研究中，将从屠宰场与超市采集的黄羽肉鸡样品在冷藏条件下存放至腐败，从腐败样品中分离到1 株莓实假单胞菌NMC25，与实验组的其他腐败菌相比，该分离株在体外具有较强的蛋白酶活性，进行原位培养时生长速度较快，肉的挥发性盐基氮值和pH值变化最为显著，并伴有异味和产黏[15]。该分离株对冷鲜肉表现出较强的致腐能力，有必要针对其致腐机制进行深入研究。

肉品的腐败通常与腐败菌的酶功能或代谢活动相关，而这些腐败菌在代谢活动中的一系列表型变化又受到它们体内诸多功能基因的操控。因此，首先需要掌握腐败菌基因组的组成和功能信息，进而明确这些基因在特定条件下的变化规律，才能深入了解这种腐败菌的致腐机制。然而在本研究之前，莓实假单胞菌的全基因组完成图序列仅公布了1 株极地环境下的分离株[16]，该环境分离株可能在基因组结构组成和代谢活性等方面与肉源性强致腐莓实假单胞菌分离株存在很大不同，不利于进一步深入研究莓实假单胞菌在肉品腐败中的作用。

因此，本研究通过对冷鲜鸡肉中分离到的强致腐莓实假单胞菌NMC25进行全基因组测序，获得其基因组的组成和功能信息，同时与其他常见假单胞菌进行初步比较基因组分析，旨在深入了解莓实假单胞菌的基因功能与代谢特征，为明确其致腐机制、开发针对性保鲜技术提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

菌株莓实假单胞菌NMC25分离自腐败的冷鲜鸡肉；细菌基因组DNA提取试剂盒DP302 天根生化科技（北京）有限公司；胰蛋白胨大豆琼脂（tryptic soy agar，TSA）、胰蛋白胨大豆肉汤（tryptic soy broth，TSB）培养基 北京陆桥技术股份有限公司。

1.2 仪器与设备

B1-150A生化培养箱 施都凯仪器设备（上海）有限公司；HVE-50高压灭菌锅 日本Hirayama公司；BCM-1600A超净工作台 苏州安泰AIRTECH公司；J2-MI高速冷冻离心机 美国Beckmen公司；Nano Drop 2000蛋白核酸微量定量仪 美国Thermo Scienific公司；DYCP-32B型琼脂糖水平电泳仪 北京六一生物科技有限公司；Universal Hood II凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化与培养条件

将冻存于-80 ℃的莓实假单胞菌NMC25菌株在TSA平板上划线，28 ℃恒温培养箱中培养24～48 h，挑单菌落接种于TSB中进行第2次活化。取二次活化的菌液再次接种到TSB中，置于28 ℃恒温培养箱中培养，取对数末期菌液备用。

1.3.2 细菌基因组提取

采用天根细菌基因组提取试剂盒，将培养至对数末期的菌液10 000×g离心1 min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2 次，收集菌体沉淀。向其中加入200 μL缓冲液GA重悬菌体，再加入220 μL缓冲液GB振荡15 s，70 ℃放置10 min后加入220 μL无水乙醇振荡15 s。将所得溶液和絮状沉淀加到吸附柱CB3中，13 400×g离心30 s弃去收集管中废液，加入500 μL缓冲液GD，相同条件离心后使用600 μL漂洗液PW漂洗2 次，弃去废液后将吸附柱置于室温晾干残余漂洗液。将吸附柱转入干净的离心管中，最后向吸附膜的中间部位悬空滴加200 μL Tris-EDTA洗脱缓冲液，室温放置5 min后13 400×g离心2 min，将细菌基因组收集在离心管中。

1.3.3 细菌全基因组测序及基因功能注释

提取好的细菌基因组使用NanoDrop 2000检测纯度，使用琼脂糖凝胶电泳检测有无降解，使用Qubit荧光光度计检测浓度与总量。DNA样品检测合格后采用三代测序PacBio RS II并对测序结果进行拼接组装为1 条contig，0 个gap。基因组的完成图测序在广州基迪奥生物科技有限公司完成。测序完成后对测序产生的原始reads进行评估，再通过过滤去掉长度小于100的reads，去掉平均质量值小于0.80的reads得到高质量的reads，然后进行基因组的组装和注释。使用glimmer软件对基因组进行基因预测，获得基因组详细的基因分布和结构信息，随后整合多个数据库, 如Cluster of Orthologous Groups of proteins（COG）[17]、Gene Ontology（GO）[18]、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）[19]和Carbohydrate-Active Enzymes（CAZy）[20]等，通过序列比对进行预测基因的功能注释。

1.3.4 基因组共线性分析和进化分析

选择NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中已公布的几种不同的假单胞菌，基于序列信息与NMC25进行BLAST比对，参数E值设置为10-5，比对时查询序列长度超过1 000 bp，序列一致性超过80%则认为核苷酸序列同源。选择菌株包括铜绿假单胞菌PAO1（P. aeruginosaPAO1，NCBI登录号NC_002516.2）、恶臭假单胞菌KT2440（P. putidaKT2440，NCBI登录号NC_002947.4）、荧光假单胞菌F113（P. fluorescensF113，NCBI登录号NC_016830.1）、莓实假单胞菌P121（来源于极地环境，NCBI登录号NZ_CP013861.1）和莓实假单胞菌NRRLB-727（来源未知，NCBI登录号NZ_LT629783.1）。使用SVG将结果图形化展示，利用MEGA 6通过邻接法构建进化树。

最后将测得的NMC25基因组序列上传至NCBI，获得GenBank登录号。

2 结果与分析

2.1 基因组特征分析

莓实假单胞菌NMC25基因组完成图信息公布在GenBank中，登录号为NZ_CP021132.1。 NMC25基因组组装为4 个Scaffold，包含1 个染色体和3 个质粒，测得的总基因组大小为5.152 13 Mb，GC含量为59.21%。菌株基因组中包含4 725 个基因（染色体4 571 个，质粒154 个），编码区基因4 494 个（染色体4 366 个，质粒128 个），结构RNA 97 个（rRNA 25 个，tRNA 72 个）。

2.2 基因组功能注释

2.2.1 COG注释分析

COG是对蛋白质进行直系同源分类的数据库，将测定的序列与数据库进行比对预测这些蛋白可能的功能并对其做功能分类统计。由图1可知，在基因组的直系蛋白聚类分析中，除R（一般功能预测）蛋白之外，数量最多的是E（氨基酸转运与代谢）相关蛋白，数量超过了500 个；其次是T（信号转导机制）、P（无机离子转运与代谢）和K（转录相关蛋白），数量均超过了400 个；与氨基酸相比，碳水化合物和脂质转运代谢相关蛋白数量较少，均不超过200 个。

图1 莓实假单胞菌NMC25基因组的COG功能分类Fig. 1 COG function classification of P. fragi NMC25 genome

2.2.2 GO注释分析

使用BLAST2 GO软件得到NMC25 基因组的GO功能注释结果，选取基因数量最多的10 个GO功能分类见表1。GO总共有3 个大类，分别描述基因参与的生物学过程、分子功能和细胞成分。在生物学过程分类中，参与代谢过程的基因数量最多，为1 921 个；在细胞成分分类中，与膜相关的基因数量最多，为679 个；在分子功能分类中则是催化活性基因数量最多，为1 899 个。整体来看，能够参与细菌代谢过程和催化反应的基因数量最多。

表1 莓实假单胞菌NMC25基因组的GO功能分类Table 1 GO terms of P. fragi NMC25 genome

2.2.3 KEGG注释分析

KEGG是系统分析基因产物在细胞中代谢途径以及这些基因产物功能的数据库，利用KEGG 可以进一步研究基因在生物学上的复杂行为。在NMC25基因组中共有1 474 个基因注释到了KEGG通路中，从中选取数量最多的10 个通路展示，如表2所示。其中，富集到ABC转运蛋白、双组分系统、氨基酸合成和碳代谢通路的基因数量最多，分别为183、171、127 个和111 个。ABC转运蛋白广泛存在于微生物体内，在离子、单糖、氨基酸、磷脂、肽、多糖及蛋白质等营养摄取的过程中扮演了重要的角色[21]；而双组分系统可以调控氨基酸代谢和介导假单胞菌对外界环境的应激响应[22]。此外，参与鞭毛组装、细菌分泌系统和氧化磷酸化相关通路的基因数量也较多。

表2 莓实假单胞菌NMC25基因组的KEGG注释Table 2 KEGG pathways of P. fragi NMC25 genome

2.2.4 CAZy注释分析

CAZy数据库包括能催化碳水化合物降解、修饰以及生物合成的碳水化合物相关酶系家族。注释结果显示，在NMC25基因组中包含大量糖基转移酶和糖苷水解酶，分别为1 528 个和1 324 个（图2）。糖基转移酶能够催化活化的糖连接到不同受体分子上，例如参与细菌胞外多糖的生物合成[23]；糖苷水解酶作为糖类代谢的关键组分，能够催化各种糖基化合物中糖苷键的水解。除此之外，糖基转移酶和糖苷酶还与受体分子的糖基化有关[24]。而糖基化在膜蛋白介导的细胞保护、稳定及屏障等方面起到重要作用，有助于NMC25应对外界的环境应激。

图2 莓实假单胞菌NMC25基因组的CAZy分类Fig. 2 CAZy classification of P. fragi NMC25 genome

2.3 共线性分析

一般来说，如果两个物种之间的亲缘关系很近，那么基因的序列和顺序都会非常接近，这种现象称为共线性现象[25]。共线性主要反映基因组间的结构性变异，反映出基因组之间的编码顺序和结构的同源性。从图3可以看出，NMC25菌株与KT2440、F113和PAO1相比，基因组更小且存在共线性的序列比例均小于50%；对于另外两株莓实假单胞菌，虽然在基因组内部存在颠换现象，3 株莓实假单胞菌的基因组更为相似，其中NMC25菌株与NRRL B-727菌株有共线性的序列达到了90%以上，但与P121菌株的共线性不足70%。

图3 莓实假单胞菌NMC25与恶臭假单胞菌KT2440（a）、荧光假单胞菌F113（b）、铜绿假单胞菌PAO1（c）、莓实假单胞菌NRRL B-727（d）和莓实假单胞菌P121（e）基因组共线性分析Fig. 3 Synteny analysis of genomes between P. putida KT2440 (a),P. fluorescens F113 (b), P. aeruginosa PAO1 (c), P. fragi NRRL B-727 (d),P. fragi P121 (e) and P. fragi NMC25

2.4 进化分析

使用不同菌株之间的单拷贝同源基因绘制进化树。从图4可以看出，NMC25与NRRL B-727菌株的进化关系最近，其次是P121。而在其他3 种假单胞菌中，与F113的进化关系最近，与PAO1最远。同时验证各分支的可信度百分比，发现铜绿假单胞菌PAO1与其他5 株假单胞菌差异较大。对6 株假单胞菌的进化分析结果与共线性分析的结果一致。

图4 不同假单胞菌的进化分析Fig. 4 Phylogenetic trees of different Pseudomonas species

3 讨论与结论

假单胞菌属内有多个种，广泛存在于土壤、水及各种植物体中。其属内菌种表现出了丰富的代谢多样性和广泛的定殖环境[26]。目前对冷鲜肉腐败菌的研究已逐渐深入到基因水平，本团队在前期利用宏基因组测序测定了托盘包装下冷鲜鸡肉的菌落组成多样性，发现其中丰度最高的是莓实假单胞菌，其次是荧光假单胞菌[27]。然而假单胞菌属中不同种、不同分离株之间的腐败能力会存在较大差异。莓实假单胞菌的优势腐败菌地位与其基因组结构组成密切相关，要对其致腐过程有深入了解需要全面明确其基因组信息。但由于目前已公布基因组完成图的莓实假单胞菌仅有1 株，且菌株来源为极地环境，不一定能准确反映具有强致腐能力的肉源性莓实假单胞菌分离株的基因组特征，因此对分离到的肉源性强致腐菌株NMC25进行了全基因组完成图测序。随后为探究造成这些菌株腐败能力差异的原因，选择已公布序列的铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌和荧光假单胞菌代表菌株以及另外两株莓实假单胞菌分离株进行了初步的比较基因组的分析。

由微生物引起的腐败现象主要包括变色、异味和产黏，这些腐败特征主要取决于微生物对肉中各种基质的利用情况。全基因组测序结果发现NMC25基因组中有大量氨基酸转运代谢相关基因，表明该菌可能较多地参与氨基酸转运代谢，因此肉类等高蛋白食品可作为其适宜的生长基质。研究表明，肉中的优势腐败菌可产生挥发性化合物导致异味的出现[28]。在细菌代谢产生的挥发性化合物中，醇类[29]、醛类[30]和硫化物[31]等物质均与氨基酸代谢有关。在基因组的GO基因功能分类中发现有大量代谢和催化反应相关的基因，推测NMC25的代谢活性可能比较旺盛，在合适的基质上生长时会进行活跃生长和代谢。KEGG分析结果表明NMC25中的基因富集到了ABC转运蛋白、双组分系统、鞭毛组装、细菌分泌系统和氧化磷酸化相关通路，这有助于NMC25在肉品这一富含蛋白质的环境中生长，接触到介质表面时会快速黏附和扩散，同时在分子跨膜转运、感受外界环境变化时做出应激响应、分泌代谢产物和产生能量等方面有较大优势。除此之外，NMC25基因组中包含大量糖基转移酶和糖苷水解酶。有研究表明，当肉品中假单胞菌数量较少时，初级代谢的主要能量来源是葡萄糖[28]，此时NMC25可快速充分利用葡萄糖进行代谢和生物合成；随着葡萄糖逐渐被利用，细菌数量迅速增加，开始产生各种胞外酶利用蛋白质等其他底物，产生氨、胺、硫化氢等物质导致肉的腐败[3]。莓实假单胞菌NMC25基因组中包含的这些功能基因使其具备在冷鲜肉上快速代谢和扩散的能力，最终导致冷鲜肉腐败。

在比较基因组分析中，莓实假单胞菌与其他3 种假单胞菌的共线性较低。一般来说，如果2 个物种之间的亲缘关系很近，那么基因的序列和顺序都会非常接近。结合进化分析结果，可以表明莓实假单胞菌与假单胞菌属的其他3 种假单胞菌尤其是铜绿假单胞菌PAO1的基因组差别较大、进化关系较远。此外，肉源性分离株NMC25与极地环境来源分离株P121基因组差别较大，说明生长环境不同，莓实假单胞菌的基因组组成结构确实存在差异，有必要对NMC25分离株的基因组进行测序。而NRRL B-727菌株基因组与NMC25共线性程度非常高，只是存在颠倒、易位等基因重组事件，因此推测这两株菌在进化过程中起源可能是一致的，NRRL B-727可能也具有较强的致腐能力。

综合上述结果，莓实假单胞菌NMC25分离株作为1 株具有较强致腐能力的菌株，其基因组中也包含大量可能导致食品尤其是肉品腐败的功能基因与代谢通路。本研究从基因水平上证明了该分离株具有较强的致腐潜力，对后续研究深入挖掘莓实假单胞菌的代谢特征，明确其致腐机制具有重要的意义。