赵珊珊, 李敏敏, 李瑞瑆, 全 蕊, 陈捷胤,戴小枫, 孔志强*,, 田 健*,,4

(1. 河北农业大学 食品科技学院，河北 保定 071001；2. 中国农业科学院 植物保护研究所，北京 100193；3. 中国农业科学院 农产品加工研究所，北京 100193；4. 中国农业科学院 生物技术研究所，北京 100081)

葡萄是酿造葡萄酒的主要原料，但因葡萄种植过程中霜霉病、炭疽病、白腐病、灰霉病和白粉病等病害多发，在生产种植过程中需大量使用杀菌剂[1]。研究人员对葡萄及葡萄酒样品抽检发现，葡萄酒中三唑类杀菌剂检出率较高，其中戊唑醇被广泛检出，其含量在0.002～0.298 mg/kg之间[2-3]。戊唑醇因具有杀菌谱广、活性强和持效期长等优点而在葡萄种植过程中大量使用，但由于其持效期长频频引发葡萄及葡萄酒中农药残留事件[3-4]。农药残留不仅带来食品安全问题，同时还会造成葡萄酒品质降低、风味物质改变[5-6]。研究发现，酿酒酵母等微生物在发酵过程中对残留农药造成化学和生物性降解，酵母细胞壁中的多糖、蛋白质等可提供多种功能基团，例如羧基、羟基、巯基、磷酰基和氨基等，可参与结合农药等有害物质[7]，使发酵后葡萄酒中大部分农药残留水平改变[8-10]，甚至产生比母体毒性更大的物质，例如酵母可将残留的三唑酮代谢生成比母体毒性更大的三唑醇[11]。另一方面，农药残留在影响葡萄酒安全性的同时，也会使葡萄酒发酵过程延缓，并且对酵母细胞造成不同程度的损伤[8,12]，从而造成葡萄酒风味品质的改变。Cabras等[13]指出，灭菌丹可以完全抑制酵母菌Saccharomyces cerevisiae和Kloeckera apiculata的发酵作用，González-Álvarez等[14]研究发现，氰霜唑、噁唑菌酮和双炔酰菌胺可对白葡萄酒中6种芳香类物质的含量造成一定的影响。

目前，葡萄酒酿制过程中农药残留研究主要集中在残留分析方法开发及葡萄酒加工过程中单一酿酒酵母对农药残留的影响和风味干扰[15-17]，缺乏系统研究不同酿酒酵母对葡萄酒酿酒过程中农药残留的影响，尚未见关于戊唑醇残留干扰葡萄酒发酵过程后风味物质研究报道。为此，本研究通过利用不同酿酒酵母模拟葡萄酒酒精发酵过程，系统评价其对戊唑醇残留的影响，同时利用电子感官评价系统明确戊唑醇残留是否造成风味品质差异，进而通过SPME-GC-MS明确戊唑醇残留对酒精发酵后葡萄酒挥发性风味物质造成的影响。旨在明确对戊唑醇降解作用效果明显且能够稳定保持葡萄酒风味品质的酿酒酵母，为葡萄酒酿造菌株的选择提供参考，同时为葡萄酒生产过程中安全评价提供科学数据支撑。

1 材料与方法

1.1 供试材料

戊唑醇 (tebuconazole) 标准品 (德国Dr. E公司，纯度>99%)；分析纯氯化钠和无水硫酸镁 (国药集团化学试剂有限公司)；色谱纯二甲基亚砜(DMSO)、乙腈 (美国Thermo Fisher Science公司，纯度>99.5%)；分散净化剂N-丙基乙二胺 (PSA，博纳艾杰尔科技有限公司)；葡萄酒果酒酿酒酵母(文中简称帝伯仕，烟台帝伯仕酵母有限公司)；酿酒酵母：71B、2323、AC、BO213、RC212、D254、EC1118、F15、F33、KD和X16 (法国LAFFORT公司)；模拟葡萄汁培养基 (MSM medium base，招远拓普生物工程有限公司)。

1.2 仪器与设备

Agilent 1290超高效液相色谱仪和Agilent 6470三重四极杆质谱检测器 (美国Agilent公司)；Eclipse PlusC18 RRHD色谱柱 (2.1 × 50 mm，1.8 μm，美国Agilent公司)；PEN3.5型电子鼻 (德国Airsense公司)，是由W1C、W5S、W3C、W6S、W5C、W1S、W1W、W2S、W2W和W3S等10个金属氧化物气敏传感器组成的阵列传感器；AsrreeⅡ/LS16型电子舌 (法国Alpha MOS公司)，由7个化学选择性区域效应的味觉传感器和1个Ag/AgCl参比电极组成，对酸、咸和鲜3种基本味觉呈味物质都有响应；GC-MS QP2010 plus气相色谱-质谱联用仪 (日本岛津国际贸易有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 模拟葡萄酒酒精发酵 模拟葡萄汁培养基可以模拟葡萄汁成分，适于研究葡萄酒酵母的发酵特性，并且在本研究中可以克服真实葡萄原料本身含有的外源性农药以及其他葡萄酒加工工艺带来的影响，使试验具有更佳的重现性[18-20]。

模拟葡萄汁培养基：称取MSM培养基207.0 g于1 L超纯水中，混匀，用5.0 mol/L 的氢氧化钠调节pH值至3.3，在超净台中用0.22 μm一次性水系针头式过滤器除菌，现配现用。

1.3.1.1 酵母活化 将12种活性干酵母分别溶于50倍体积的2%蔗糖水中，在32 ℃水浴中复水活化20 min，酵母接种量为10 g/50 L。

1.3.1.2 模拟葡萄酒发酵处理 共设A、B、C 3组试验：戊唑醇对照 (A组)，仅添加戊唑醇标准溶液至2 mg/L，共1个处理。酵母对照 (B组)，分别添加12种酵母活化液，不添加戊唑醇标准溶液，共12个处理。试验组 (C组) 根据GB 2763—2019中戊唑醇在葡萄中的最大残留限量，在模拟葡萄汁中添加戊唑醇标准溶液的质量浓度为2 mg/L[21]，添加后静置30 min，再添加酿酒酵母活化液，共12个处理。3组试验中每个处理重复3次。处理后的模拟葡萄汁经酒精发酵 (25 ℃ ± 1 ℃，7 d) 后采集发酵液进行分析[22-24]。

1.3.2 模拟葡萄酒发酵液中农药残留测定

1.3.2.1 样品前处理 取5.0 mL发酵液至15 mL离心管中，加入5.0 mL乙腈，涡旋振荡2 min；加入4.0 g 氯化钠和1.0 g无水硫酸镁，涡旋振荡1 min后于5 000 r/min下离心5 min；取上清液1.0 mL，转移至含有50 mg PSA和150 mg无水硫酸镁的2 mL离心管中，涡旋振荡1 min后于6 000 r/min下离心1 min；取上清液，过0.22 μm有机相滤膜，待测。

1.3.2.2 仪器检测条件

色谱条件：流动相A为体积分数为0.05%的甲酸水溶液；B相为乙腈，流速0.4 mL/min，进样量2 μL。梯度洗脱程序：0～1 min，90% A；>1～4 min，15%～90% A；>4～5 min，1%～15% A；>5～6 min，1% A；>6～6.20 min，1%～90% A；>6.20～7 min，90% A；分析时间7 min。

质谱条件：采用电喷雾离子源正离子模式，干燥气温度为300 ℃，干燥气流量为5 L/min；雾化气压力为3.1 × 105Pa；鞘气温度为250 ℃，鞘气流量为11 L/min；毛细管电压为 (正) 4 000 V、(负) 3 500 V；喷嘴电压为 (负) 1 500 V；母离子选择308.2m/z，子离子选择123、70.1m/z，破裂电压为112 V，对应的碰撞能量为37和21 eV。

1.3.3 模拟葡萄酒发酵液电子鼻风味分析 准确量取3.0 mL发酵液于进样小瓶中，在25 ℃ ± 1 ℃下静置10 min，使样品挥发性气体充满气质瓶顶空空间，每个样品重复3次。电子鼻开机后进3针空气样品，待仪器稳定后开始检测样品，检测过程中，传感器自动清洗时间为180 s，样品测试分析时间为60 s。采用电子鼻WinMuster系统进行载荷分析 (Loading analysis)[25-26]，数据采用区间选择较为稳定的35～39 s。

1.3.4 模拟葡萄酒发酵液电子舌滋味分析 准确量取20.0 mL发酵液，用超纯水稀释至150.0 mL，封口膜密封后超声处理20 min，过0.22 μm水相滤膜；取100.0 mL至进样烧杯中进行检测，电子舌开机后活化传感器，建立样品分析表，样品烧杯与超纯水烧杯依次间隔摆放在样品盘上，在样品盘上添加完样品后开始进行电子舌扫描检测，每采样1次，传感器进入超纯水清洗1次。为了避免初始检测响应信号不稳定，每个样品重复扫描检测7次，在获得分析数据后，摒除前3次数据，只采用后4次稳定的电子舌响应数据。运用电子舌自带分析软件进行味觉差异分析。

1.3.5 主要风味物质SPME-GC-MS定性分析 准确量取3.0 mL发酵液于20 mL顶空瓶内，采用固相微萃取方法提取易挥发性化合物，再通过气相色谱-质谱联用仪对这些化合物进行分离并分析。运用NIST11数据库对未知挥发性化合物谱图进行比对定性[27]。

1.3.5.1 固相微萃取条件 将样品置于50 ℃下平衡20 min，用65 μm PDMS/DVB萃取头插入顶空瓶中萃取40 min后拔出并置于200 ℃的进样口中解吸2 min。

1.3.5.2 色谱-质谱条件 DB-WAX色谱柱 (30 m ×0.25 mm，0.25 μm)，柱温箱初始温度40 ℃，进样口温度200 ℃，不分流进样，载气流速1 mL/min，柱温箱升温程序为40 ℃保持3 min，5 ℃/min升至120 ℃，10 ℃/min升至200 ℃，保持5 min。离子源温度为200 ℃，传输线温度为250 ℃，采用全扫描 (Scan) 模式采集信号，扫描范围m/z35～500。

2 结果与分析

2.1 不同酵母对农药残留降解影响

2.1.1 标准溶液配制及标准曲线建立 准确称取一定量戊唑醇标准品，用DMSO溶解，配制成1 000 mg/L的戊唑醇标准储备液。按1.3.2.1节中样品前处理的方法，用空白模拟葡萄汁发酵液基质溶液稀释戊唑醇标准储备液，配制成0.05、0.1、0.5、1和2 mg/L的系列戊唑醇基质匹配标准溶液。以峰面积为纵坐标，以相应的戊唑醇浓度为横坐标绘制标准曲线，得到的标准曲线线性方程为：y= 101x+ 1 033.1，R2= 0.999 4，表明戊唑醇在0.05～2 mg/L范围内线性关系良好。

2.1.2 残留分析方法验证 向空白模拟葡萄汁发酵液中分别添加0.05、0.1和0.5 mg/L 3个水平的戊唑醇标准溶液，涡旋2 min，静置2 h，每个水平重复5次。按1.3.2.1节样品前处理方法进行处理，回收率在102%～105%，相对标准偏差 (RSD)为0.80%～4.5%，方法检出限 (LOD) 为0.015 mg/L，定量限 (LOQ) 为0.05 mg/L，表明该方法的准确度和精密度满足农药残留分析的要求[28]。

2.1.3 不同酿酒酵母对戊唑醇残留降解效果 由图1可知：模拟葡萄汁经不同酿酒酵母发酵后，葡萄酒中戊唑醇含量均有不同程度的降低，降解率在10%～23%之间，而未添加酵母菌的模拟葡萄汁 (CK) 戊唑醇含量没有发生显著变化，说明酿酒酵母对戊唑醇有一定的降解作用。D254、RC212、BO213和AC对戊唑醇降解效果相对优于其他酿酒酵母菌株 (P< 0.05)，降解率超过20%，分别为22.9%、21.9%、21.6%和21.3%。帝伯仕酿酒酵母对戊唑醇降解率显著低于其他11种酵母菌 (P<0.05)，仅有10.1%；2 323、F33和F15也表现出较低水平的降解作用，且显著区别于D254和RC211。

2.2 电子鼻载荷分析

PEN3.5电子鼻共有10个金属氧化物气敏传感器 (W1C对苯类芳香成分敏感；W5S对氮氧化合物敏感；W3C对芳香胺类成分敏感；W6S对氢气、氢化合物敏感；W5C对烷烃芳香成分敏感；W1S对甲基类敏感；W1W对硫类化合物敏感；W2S对醇类及芳香族化合物敏感；W2W对芳香成分和有机硫化物敏感；W3S对烷烃类敏感)。对B、C两组样品进行载荷分析，从而判断各传感器在两组样品挥发性风味物质差异分析中的贡献率。结果如图2所示，第1主成分的贡献率为94.01%，第2主成分的贡献率为4.59%。载荷的绝对值越大，对主成分影响越大[29]。从中可看出，在本次模拟葡萄酒发酵液的气味识别中，W1W传感器对PC1和PC2的贡献率最大，其次是W1S传感器，另外W2W传感器在PC1的区分发挥较大作用，说明第一主成分主要反映的是硫类、甲基类和芳香类化合物。W1C、W3C和W2S所测数据点位置较为聚集，因此发挥作用较为相似，反映芳香类化合物对主成分的贡献。W5C、W6S和W3S测得数据点较接近且在主成分1、2中的载荷值均靠近0，故对样品间的区别贡献不大，即本次模拟发酵产生的香气物质中烷烃类并未表现出明显差异。因此可初步判定，葡萄酒发酵受戊唑醇影响后，可能在芳香类化合物、含硫化合物和甲基类化合物等风味物质类群产生较大变化。

2.3 电子舌滋味分析

滋味是评价葡萄酒品质的重要指标，电子舌分析系统中，AHS为酸味传感器，SCS为苦味传感器，ANS为甜度传感器，NMS为鲜味传感器，CTS为咸味传感器，CPS与PKS为通用传感器。通过电子舌系统对B、C两组样品的呈味成分进行检测分析，将组间与组内的检测结果分别进行比对。表1为同种酵母在B、C两组不同处理下表现出的7个传感器综合分析下的味觉风味差异。12种酵母菌中有8种使其B、C两组样品的味觉风味在7个传感器综合评价下差异值达到90以上，另外4种酵母 (AC、F15、EC1118、RC212)差异值均在80以下，受戊唑醇影响最小的是AC，为22.1。图3为酵母AC发酵液的味觉分析对比图，从中也可以看出其传感器响应值的相似度极高。

表1 各模拟发酵液味觉差异表Table 1 Differences in taste of each simulated fermentation broth

2.4 SPME-GC-MS分析

分别对B、C两组发酵液样品进行SPME-GC-MS检测分析，检出物质的匹配度大于或等于80的具有参考意义，共检出63种挥发性成分。其中，醇类18种，酯类22 种，酸类7种，烷类6种，其他10种。首先，乙醇、异戊醇、(2R,3R)-(－)-2,3-丁二醇、正己酸乙酯、辛酸乙酯和正癸酸乙酯在所有样品中均被检出。苯甲醇只在所有酵母对照(B组)样品中检出，而B组样品是没有经过戊唑醇处理的模拟葡萄酒发酵液，说明戊唑醇残留对发酵葡萄酒中苯甲醇产生一定抑制作用，而苯甲醇在葡萄酒中呈苦杏仁味、脂肪味，是一种重要的芳香醇类物质。其次，戊唑醇使2323、RC212、71B、D254、BO213、AC和KD 发酵下的7种发酵液生成呈菠萝香气的庚酸乙酯，抑制酵母菌F33、X16、RC212、71B、AC、帝伯仕酿酒酵母产生呈水果香气的辛酸异戊酯，抑制酵母菌F33、X16、2323、RC212、71B、D254、AC、KD、帝伯仕酿酒酵母生成苯甲醇 (苦杏仁味、脂肪味)、苯乙醇(清甜玫瑰香)、癸酸3-甲基丁酯、9-十六碳烯酸乙酯。另外异戊酸 (甜润果香味、笃斯越橘味)、正己酸 (干奶酪气味、汗臭味) 等物质的生成也受到一定影响。Noguerol-Pato等[30]发现，戊唑醇可能会刺激葡萄酒发酵过程使之产生葡萄品种香、醇香、花香气味，减少梨香、热带水果和蔬菜系列气味。本研究结果与之基本一致。

进一步研究发现，12种酿酒酵母中，AC菌株发酵的B、C组两样品间相同物质的数目最多，其峰重合度最高 (图4)，表2中为SPME-GCMS检测AC菌株模拟发酵下葡萄汁发酵液的主要挥发性成分表，酵母对照B组 (B-AC) 检出22种物质，戊唑醇处理的C组 (C-AC) 检出15种物质，共有14种相同成分，说明在模拟发酵过程中，AC菌株发酵产生的挥发性物质受戊唑醇影响最小，此结果与电子舌分析结果一致。

表2 酵母菌AC模拟葡萄汁发酵液发酵产生主挥发性成分Table 2 AC simulates the main volatile components produced by fermentation of grape juice fermentation broth

3 结论与讨论

残留在葡萄中的杀菌剂会随加工过程转移到葡萄酒中[10,31]。葡萄酒不同加工过程会影响农药残留的水平和分布[32]。本研究采用模拟葡萄汁培养基模拟葡萄酒酒精发酵过程，系统研究不同酵母菌发酵对戊唑醇降解的影响。结果发现，所选酵母菌对戊唑醇的降解率在10%～23%之间，其中D254、RC212、BO213和AC对戊唑醇降解效果优于其他酿酒酵母菌株 (P< 0.05)，而帝伯仕酿酒酵母则对戊唑醇降解效果不明显，降解率低于15%。该结果与前人研究结果相似[9,33]。戊唑醇降解率的大小差异可能是由于酿造条件的不同造成。

残留在葡萄酒中的农药会影响酵母菌的正常生长代谢从而造成葡萄酒风味品质的变化。前人研究发现，嘧霉胺、季铵盐类杀菌剂、50%烯酰吗啉水分散剂[34]和百菌清[35]会影响酵母的发酵速率、延长发酵时间，影响CO2和酒精等生成量；氧乐果、杀螟硫磷和三唑酮对葡萄酒发酵过程影响并不大，只是在一定程度上缩短了发酵时间[15]。即不同农药类型会选择性影响酵母菌群。而葡萄酒香气大部分来自发酵阶段产生的香味物质，杀菌剂可以通过抑制微生物发酵活性干扰葡萄酒酿制，从而造成发酵过程中微量成分代谢及含量差异，导致对葡萄酒感官质量的不良影响，进而降低葡萄酒香气的纯正度和口感的协调性[36-38]。本研究中，利用电子舌和电子鼻系统，对添加戊唑醇后不同酵母菌在模拟葡萄汁培养基中发酵产生的风味品质进行区分。结果显示，戊唑醇会影响酵母菌发酵过程，从而带来香气产物的差异，12种酵母菌产生的香气物质均受到不同程度的影响。

基于SPME-GC-MS分析发现，与酵母对照B组样品相比，戊唑醇处理的C组样品均未检测出苯甲醇，造成风味缺失，12种酵母菌中，AC菌株表现出较为稳定的产香性能，且成品酒可较好保持葡萄品种香，具有起酵快、发酵温度范围大的特点，是酿酒常选菌种。另外，12种酵母菌发酵产生的香气物质受到戊唑醇残留的影响不同，这可能是由于酵母菌本身对戊唑醇的敏感性不同。Mulero等[5]研究发现，喹氧灵处理过的葡萄发酵后酚类化合物显著高于对照组，肟菌酯处理的葡萄酒总酚含量 (包括二苯代乙烯类) 明显低于对照组，经甲基醚菌酯、噁唑菌酮和氟喹唑处理过的葡萄酒发酵后总酚含量微有下降。Noguerol-Pato 等[39]用抗真菌剂处理格拉西亚诺，成品酒中挥发性化合物 (单萜和C13-降异戊二烯衍生物) 和醛类物质含量显著增加，醋酸盐和芳香醇的浓度降低，这些结果同样验证了杀菌剂与酵母菌发生作用时的相互选择性。葡萄酒酿造中微生物发酵是一个极其复杂的过程，生产中葡萄酒中的农药残留种类不单一且受野生菌株影响，因此未来应继续对杀菌剂与酵母之间的相互选择带来的影响进行深入探究，并且应考虑加工工艺条件差异对葡萄酒风味品质产生的影响。