张成龙, 国 菲, 杨瑞琴*,, 李 鹏*,,3

(1. 中国人民公安大学 侦查学院，北京 100038；2. 山东省淄博市公安局刑侦支队，山东 淄博 255000；3. 山西医科大学，太原 030001)

有机磷农药是人工合成的磷酸酯类化合物，具有广谱、高效和低残留等特点，在国内外农业和园林种植领域得到广泛应用[1-2]。该类物质毒性大，因误服导致的急性中毒事件、自杀和投毒事件时有发生。据世界卫生组织报道，每年有300多万起有机磷农药意外中毒事件和自杀、投毒案件发生[3]。要想查明真相，确定中毒毒物的种类及含量，及时快速开展毒物检验工作是第一步，但大多数有机磷农药体内代谢或体外分解较快[4-6]，从中毒发生到检材提取再到检材检测有一定时间的延迟，致使有机磷农药定量检测浓度与实际中毒浓度往往相差较大，送检不及时，甚至会出现假阴性现象。有机磷农药代谢物作为中毒生物标志物之一[7]，具有监测有机磷农药接触水平[8-11]、毒性反应[12-14]及预测可能毒性的作用[15-16]。因此，对生物检材中有机磷农药代谢物的准确检测具有重要意义。

1 有机磷农药体内代谢概述

有机磷农药通过无损皮肤、消化道及呼吸道等途径进入人体内后，可迅速分布于全身脏器并与乙酰胆碱酶结合，造成轻重不等的中毒现象[17]。有机磷农药种类不同，其在体内的代谢也有一定差异[18]，其中肝细胞多功能氧化酶的氧化作用和磷酸三酯酶的水解作用为其在体内主要代谢途径[19-21]。其代谢物大体可分为两类：一类是二烷基磷酸酯类化合物 (DAP)。多数有机磷农药可代谢为1种及1种以上的DAP[22]，人体在接触有机磷农药后的24～48 h 在尿流中可检测到DAP[7]，DAP包括磷酸二甲酯 (DMP)、磷酸二乙酯 (DEP)、二甲基硫代磷酸酯 (DMTP)、二乙基硫代磷酸酯 (DETP)、二甲基二硫代磷酸酯 (DMDTP) 和二乙基二硫代磷酸酯(DEDTP) 6种化合物。另一类是特殊代谢物(SM)。SM是一种或少数几种有机磷农药的代谢物，具有特异性。在实际案件中，可结合具体案情确定农药的种类，例如：2-异丙基-4-甲基-6-羟基嘧啶 (IMPY) 为二嗪磷的特殊代谢物，2-(二乙氨基)-6-甲基-4-羟基嘧啶 (DEAMPY) 为甲基嘧啶磷的特殊代谢物，对硝基酚 (PNP) 为对硫磷和甲基对硫磷特殊代谢物，3,5,6-三氯-2-吡啶醇 (TCP)为毒死蜱和甲基毒死蜱的特殊代谢物等[22-23]。

2 有机磷农药代谢产物实验室检测技术及应用

2.1 气相色谱分析技术

气相色谱 (GC) 技术是实验室常用的分析手段之一，灵敏度较高，其中火焰光度检测器的使用对含磷的代谢物具有良好选择性。由于二烷基磷酸酯类化合物极性较高，采用GC进行检测时，前处理常用五氟苄基溴 (PFBBr) 对6种DAP进行衍生反应以降低其极性，但该过程繁琐费时，且衍生试剂具有强烈刺激性气味，污染环境。

Aprea等[24]介绍了一种精确、重现性强的定量测定尿样中6种DAP的分析方法。分别在室温和90 ℃条件下对尿样中含硫DAP和不含硫的DAP分两步衍生，经CN柱净化，用毛细管气相色谱−火焰光度检测器 (GC-FPD) 技术检测。该方法准确度及精密度均较高，检出限在2～3 ng/mL之间，可满足职业暴露和普通人群中的DAPs检测。Oglobline等[25]采用改进的气相色谱法分析了有机磷农药接触工人尿液中的6种DAP，通过PFBBr对6种DAP进行衍生化处理，尿液样本经冻干后，采用双毛细管柱GC-FPD方法测定，检出限为5～50 ng/mL。该方法前处理使用冷冻干燥机处理可大大缩短样本制备时间，适用于职业性接触有机磷农药工人尿液的大批量常规分析。

杨玉林等[26]采用GC-FPD检测技术建立了尿液中6种DAP的定量分析方法。通过衍生化温度、时间等条件的优化，选用50 ℃下进行PFBBr一步衍生，反应14～16 h，以二丁基磷酸酯 (DBP)为内标，直接进样，大大简化了操作步骤，并在衍生过程中充入高纯氮，有效避免了含硫代谢物的氧化。6种DAP在100 ng/mL下的检出限为2～15 ng/mL，回收率为66%～90%。金忠秀等[27]创建了血浆中有机磷农药含硫代谢物DETP、DEDTP的GC-FPD检测方法。结果表明，经V(乙醚) :V(乙腈) = 1 : 1液-液萃取后，40 ℃下用PFBBr进行衍生反应4 h，能有效避免基质中相邻峰干扰，并提高分析效率。DETP和DEDTP的回收率分别为92.46% 和 98.10%，检出限分别为5.0 ng/mL和 1.0 ng/mL，经实际样本检测，证明该方法对大批量低接触有机磷农药的普通人群的分析极为有利。

2.2 气相色谱-质谱联用分析技术

气相色谱-质谱联用 (GC-MS) 技术结合了色谱的高分离效能和质谱的定性准确特点，具有更高的灵敏度和更低的检出限，样本用量少，近年来被广泛应用于有机磷农药代谢物的检测分析。

Ueyama等[28]创建了安全、灵敏的GC-MS方法，可实现对尿液中DMP、DEP、DMTP和DETP的同时检测，并对pH值对氮吹蒸发的影响、衍生反应的温度和时间、抗氧化剂的添加以及净化步骤进行了优化，检出限和定量限分别为0.1～0.3 ng/mL和0.3～1 ng/mL，回收率为60.5%～92.4%。之后，Ueyama等[29]对上述方法进行了改进，在衍生反应前增加脱水处理，并使用气相色谱-电子轰击离子源-质谱 (GC-EI-MS) 进行检测。4种分析物的检出限和定量限分别为0.05～0.15 ng/mL和0.20～0.50 ng/mL，相对标准偏差在15.7%以下，改进后的方法在高通量和低成本的情况下，获得了更高的灵敏度和精密度。

Alwis等[30]介绍了一种自动固相萃取、同位素稀释结合GC-MS/MS技术分析尿液中6种DAP的方法，分析物经过自动离线固相萃取装置提取后，采用1-氯-3-碘丙烷进行衍生反应，检出限为0.05～0.17 ng/mL，回收率为56%～104%。该方法省时、省力、重复性高，样本制备时间短，只需4 h，是之前所用时间的1/5[31]。Bravo等[32]同样采用同位素稀释结合GC-MS/MS技术对尿液中6种DAP进行定量分析，前处理使用冻干法，6种DAP检出限为0.1～0.6 ng/mL，回收率为75%～100%。通过对1 100份美国加利福尼亚州孕妇和儿童尿液样本检测分析，证实该方法的灵敏度可用于一般人群监测。之后，Alwis等[33]以磷酸二丁酯 (DBP)为内标，对尿液中6种DAP进行自动固相萃取后，改用PFBBr进行衍生化反应，GC-MS检测，检出限为0.1～0.15 ng/mL，回收率为58%～119%。较之前方法相比保持了简单、快捷、准确等优点，而且更为经济、普适，为大规模生物检材的监测提供了技术支撑。

Margariti等[34]开发并验证了GC-MS 法定量测定头发中3种DAP (DMP、DMTP、DEP) 的分析方法。前处理包括去污步骤、固液萃取、液-液萃取、PFBBr衍生化和Florisil/PSA柱净化。向空白头发样品中添加1 和10 ng/mg分析物，回收率为56.1%～107.9%，日内相对标准偏差为13.5%～17.5%。检出限为0.02～0.10 ng/mg 。Elodie等[35]采用GC-MS技术对血清和头发样品中的DMP进行检测，以研究尿道下裂与有机磷农药接触的关系。头发前处理步骤包括去污、干燥粉碎、超声辅助固-液萃取、PFBBr衍生化后氮吹至近干，定容后进样；血清前处理主要是在酸性条件下液-液萃取，之后采用PFBBr衍生化后氮吹至近干，定容后进样。研究结果表明，后代尿道下裂，父母血清和头发样本中DMP的浓度比一般人群报告的要高得多，并支持有机磷农药暴露可能是尿道下裂的潜在危险因素的假设。孙㑇琳[36]建立了高分离度、高精确性的GC-MS法，对血液和组织器官样本中对硫磷及其4种代谢物 (对氧磷、DETP、DEP和PNP) 进行检测分析，并对对硫磷的体内代谢转化进行了研究。通过优化分流比、升温程序、质谱设置等条件的优化，5种分析物在30 min内可完成分离检测，检出限为2.0～16.7 ng/mL，线性范围6.25～500 ng/mL。

Guo等[37]建立了高灵敏度GC-MS/MS方法，对尿液中DMP、DMTP、DETP和TCP进行分析，除TCP外，采用多反应离子监测 (MRM) 结合保留时间定性，内标法定量。结果检出限、定量限分别为 0.083～0.667 ng/mL、0.2～2.0 ng/mL，回收率为54.1%～68.6%。该方法选用硅烷化试剂N-(叔丁基二甲基硅烷基) -N-甲基三氟乙酰胺(MTBSTFA) 对分析物进行衍生化，所需时间大幅缩短，且不需要其他试剂参与。李晔等[38]采用GC-MS技术对尿液中DMP、DEP、DETP、DMDTP和DEDTP 5种DAP进行了测定。多篇文献给出50 ℃条件下反应16 h的PFBBr衍生条件[26]，该研究基于乙腈沸点，采用80 ℃下衍生反应30 min，并加入焦亚硫酸钠作为抗氧化剂，DAPs在0.05～10 mg/L内线性关系良好，回收率为51.6%～90.8%，检出限为1～2 ng/mL，该方法在有效保证检测准确度的同时加快了检测速度，适用于对中毒物快速检测。

Takayasu等[39]应用GC-MS技术报道了中毒病例死后甲基毒死蜱、杀虫磷及其代谢物 (TCPY、3MNP) 在血液、尿液和器官组织中的分布。对各类检材主要采用Extrelut® NT柱进行固相萃取，并在85 ℃条件下采用N-甲基-N-三甲基硅烷基三氟乙酰胺 (含1% 三甲基氯硅烷) 对TCPY、3MNP进行衍生反应，为提高定量准确性，在尿液处理前过程中加入β-葡萄糖醛酸酶，以水解目标物的葡萄糖醛酸轭合物。其中TCPY、3MNP在血液中的定量限均为10 ng/mL，回收率分别为76%～94.3%、83.9%～102%；在尿液中定量限也均为10 ng/mL，回收率分别为77.4%～95.4%、85.2%～99%。

2.3 液相色谱-质谱联用分析技术

液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 技术具有灵敏度高、重现性好、分辨率高和简便高效等优点，与其他检测方法相比，其不需要衍生化，前处理简单安全，对环境污染较小，但仪器造价和运行成本较为昂贵。

Dulaurent等[40]首次报道了溶剂萃取前处理结合LC-MS/MS技术对尿中的6种DAP同时进行检测，使用ODS3 C18色谱柱分离，多反应监测 (MRM)模式下进行质谱检测。检出限为0.5～1.3 ng/mL。该方法灵敏度高，在环境暴露的志愿者尿液中检测到DAP的存在，证实了LC–MS/MS技术在该领域的适用性，但6种DAP的回收率偏低，均在70%以下。

Odetokun等[41]开发了全自动固相萃取结合高效液相色谱-电喷雾电离-串联质谱技术，对尿中6种DAP进行定量分析。该操作系统采用96孔板-弱阴离子交换固相萃取板对分析物进行自动提取后直接进样，萃取效率为40%～98%，检出限为0.044～1.549 ng/mL。该方法大大减少了工作量，提高了工作效率，每周可检测1 152份样本，是之前检测量的两倍[32]，可用于职业和非职业有机磷农药暴露的环境及应急生物监测。Ueyama等[29]开发了一种灵敏、可靠的固相萃取结合液相色谱-串联质谱技术，检测尿液中DMP、DEP、DMTP和DETP的含量，并实际应用于日本儿童尿液中DAPs浓度的测定。该方法的优势是使用包含阴离子和阳离子配体的多模式ODS色谱柱，能较好地保留4种较高极性分析物，该方法的灵敏度较高，检出限低于0.4 ng/mL。该研究成为评估人类有机磷农药暴露风险的重要一步。

王娜等[42]建立了尿中毒死蜱等有机磷农药特殊代谢物3,5,6-三氯-2-吡啶醇 (TCP) 的超高效液相色谱-串联质谱 (UPLC-MS/MS) 分析检测方法。前处理选用V(二氯甲烷) :V(乙酸乙酯) = 20 : 80溶液对待测物进行液-液萃取，回收率高达97.9%，在电喷雾电离负离子 (ESI−) 模式下，选择离子监测(SIR) 方式检测，检出限为0.41 ng/mL。该方法为生物负荷的痕量监测提供了技术支撑。Davis等[43]采用高效液相色谱-串联质谱 (HPLC-MS/MS) 技术，对尿液中几种农药的12种生物标记物进行定量分析，其中包括有机磷农药的5种特殊代谢物(PNP、TCPY、MDA、IMPY、DEAMPY)。该方法通过使用较窄直径的分析柱和对每个分析物使用同位素稀释量化，可以达到示踪级分析所需的选择性和灵敏度，检出限低至0.04 ng/mL，回收率为94.1%～98.0%。周志荣等[44]建立了对尿液中DMDTP、DEP、DEDTP、PNP、CMHC和TCPY LC-MS/MS测定方法。采用近年国外尿样中使用的水酶解技术进行前处理，并对固相萃取柱、流动相、离子源进行了优化，检出限在2 ng/mL以下，回收率为79%～130%。该方法可同时检测DAPs和SMs，为进一步扩大有机磷农药代谢物检测范围奠定了基础。

Roca等[45]开发了液相色谱静电场轨道肼高分辨质谱方法 (LC-HRMS)，可同时检测尿液中6种DAP和多种SM，是目前国内外可同时检测有机磷农药代谢物种类最多的技术。该方法使用全扫描模式，一次检测可完成对正负离子的同时扫描，可实现对多种物质的同时检测，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间。在前处理过程中使用β-葡萄糖醛酸酶进行水解，创新性地采用改进的QuEChERS技术进行提取，有效地降低了基质效应，提高了回收率。各有机磷农药代谢物在0.8～200 ng/mL内线性关系良好，定量限为0.8～50 ng/mL，回收率为60%～120%。

3 有机磷农药代谢产物快速检测技术及应用

快速检测技术操作简便、结果直观，在现场初筛和生物监测方面发挥着重要作用[46-47]。在中毒案件中，快速检测技术可缩小实验室检测范围或直接筛查出中毒因子，为抢救中毒者赢得时间。本文介绍了3种常见的有机磷农药代谢物快速检测方法：荧光探针法、免疫分析法和生物传感器法。

3.1 荧光探针法

典型的荧光探针由识别基团 (受体)、荧光团和连接两者的连接基团所组成。荧光探针法是受体和底物集合后，导致受体分子的光物理性质发生变化，从而荧光团部分发生荧光淬灭或增强的方法[48]。Wang等[49]报道了EU3+功能化的Hf-MOF荧光探针 (Eu3+@1) 探测尿液中对硫磷和甲基对硫磷特殊代谢物对硝基苯酚 (PNP) 和杀螟松特殊代谢物3-甲基-4-硝基苯酚 (PNMC)。Hf-MOF探针上的有机配体可向Eu3+传递能量敏化Eu3+发光[50]，而PNP和PNMC与Eu3+@1在紫外吸收光谱上存在部分重叠，PNP和PNMC对辐射光竞争吸收可降低有机配体向Eu3+的传能效率，导致其荧光淬灭而被检测出来。该荧光探针对水和pH耐受性强，在1 min内可完成检测，PNP和PNMC的检出限分别为0.36 μg/mL和 0.41 μg/mL，具有快速、高效和高选择性等优点。此外，该荧光探针可循环使用，绿色环保，节约成本。

3.2 免疫分析法

免疫分析法是利用毒物与标记毒物竞争性结合抗体，从而检测毒物的方法[51-52]。Zhang等[53]报道了检测人体唾液中毒死蜱特殊代谢物TCP的纳米金免疫层析 (ITS) 技术，该技术是免疫分析法的一种，当待测物与膜上固定的纳米金标记的抗体 (或为抗原) 特异性结合后，复合物再与膜上检测线的抗原 (或为抗体) 相结合，根据检测线的颜色深浅进行定量。作者采用实验室研制的前处理缓冲液对ITS样本垫进行预处理，优化了Au纳米颗粒与TCP抗体偶联比等参数，实现了对TCP的高灵敏度和选择性的直接检测，TCP在0.625～20 ng/mL内线性关系良好，检出限为0.47 ng/mL。

3.3 生物传感器法

生物传感器法是利用生物反应或生物物质间的亲和作用，选择性地检测生物试样或系统的化学成分、提供生产过程有关信息的方法[54-55]。Zou等[56]开发了一种便携式量子点 (QD) 荧光免疫传感器，用于血浆中毒死蜱特殊代谢物TCP的生物监测。该传感器是生物传感器的一种，抗体与TCY和QD-TCY偶联体发生竞争性免疫反应后，根据其捕获量子点的荧光量实现对血浆中TCY的定量分析。该技术集成了免疫层析法、量子标记技术和X射线光电子能谱、荧光光谱技术，具有简单、快速和灵敏等优点。最佳条件下，可在15 min内完成检测，检出限为1.0 ng/mL，添加回收率102.0%，是床旁快速检测和环境生物监测的新途径之一。Wang等[57]也开发了用于血浆中TCP生物监测的免疫层析电化学生物传感器，该装置结合了电化学免疫传感器和测流免疫层析技术，竞争性酶联免疫反应在免疫色谱条带上进行，丝网印刷的碳电极测定检测区捕获的HRP标记的抗体。与传统的酶联免疫吸附法相比，该装置更为轻便、灵敏，检出限低至0.1 ng/mL，为农药中毒的临床诊断和现场快速筛查提供了可能。

4 问题与展望

现阶段，国内外对于有机磷农药代谢产物的检测分析虽已取得初步成果，但从实践的角度来看，目前的检测水平仍然存在一些问题：1) 有机磷农药在生物体内的代谢规律研究还不全面，国内外文献报道多针对原药动力学开展研究。因此，今后应继续深入研究有机磷农药的体内代谢机制，及其代谢物的稳定性和分布规律，为更全面地检测代谢物奠定基础。2) 有机磷农药代谢物快速检测技术专属性高，大多只适用于单一分析物的检测，对于多种目标物同时进行检测只能依赖于GC-MS、LC-MS/MS 等实验室确证方法。为提高检测效率，扩大检测范围，开发同时检测生物样本中包含DAPs和SMs在内的多种有机磷农药代谢物的检测技术显得尤为重要。3) 目前采用的方法以色谱-质谱联用法为主，需耗费大量的时间和有机溶剂对复杂基质进行提取和净化，以保护仪器，消除基质干扰。因此，建立简单、高效、绿色和环保的前处理方法将是今后发展趋势之一。QuEChERS技术快速、低廉、针对大部分极性较高物质回收率高，在未来必会凸显其重要性。4) 目前国内外的各种检测技术多为生物监测而开发，检测对象也以血、尿等活体生物检材为主，为满足公安机关办理有机磷农药中毒死亡案件的实践需要，需进一步探索针对死者生物检材的检测技术，为相关案件的司法鉴定提供全面的科学依据。