陈超 常娜 赵萌 张蕊 张莹

肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，肺癌的总体5年生存率仅为15%[1]。免疫抑制在肿瘤的发生和进展中起着重要的作用，肿瘤会影响机体T淋巴细胞亚群，抑制细胞免疫[2]。此外，肺癌患者往往处于高凝状态，这会增加肺栓塞的发生风险并影响预后[3]。MET-PI3K-Akt通路在肺癌患者中高表达，不但参与肺癌细胞的增殖、转移和免疫抑制，还与凝血有关，研究显示PI3K-Akt通路的激活会诱导高凝状态[4-5]。微小RNA(microRNA，miRNA)可在转录后水平上调节基因的表达参与肺癌进程，最近的临床研究显示miR-15b在肺癌患者血清中降低，并可以促进肺癌细胞凋亡，但是其作用机制尚不明确[6]。并且最新研究显示抑制miR-15b可以通过激活PI3K/AKT相关通路促进氧葡萄糖剥夺心肌细胞模型的存活[7]。综上，本文主要分析miR-15b通过调节MET-PI3K-Akt通路对肺癌模型鼠免疫功能及高凝状态的影响，并探究其作用机制。

材料与方法

一、主要实验材料

人肺癌细胞A549(ATCC公司，美国)。DMEM培养基血清和抗体(Invitrogen公司，美国)。BALB/C裸鼠(上海斯莱克实验动物中心，中国)。miR-15b类似物(mimic)、抑制剂(inhibitor)以及阴性对照(negative control，NC)(GenePharma公司，China)。LipofectamineTM 2000(Invitrogen，美国)。ELISA试剂盒和TUNEL染色试剂盒。TRIzol(Sigma公司，美国)。miScript试剂盒和PrimeScript-RT(Takara公司，日本)。anti-CyclinD1、anti-Ki67、anti-MET、anti-PI3K、anti-AKT(Abcam公司，美国)。PVDF膜(Bio-Rad公司，美国)。ECL 显色试剂盒(Thermo Fisher公司，美国)。FACSCanto II流式细胞仪和配套试剂盒(BD Biosciences公司，加拿大)。miR-15b类似物(mimic)和阴性对照(NC)(GenePharma公司，China)。LipofectamineTM 2000(Invitrogen，美国)。pMIR-REPORT 双荧光素酶试剂盒和1000 Assay System检测系统(Thermo Fisher公司，美国)。

二、分组和建模

将DMEM培养基中处于对数生长期的各组等的A549细胞分为3组：NC组、mimic组和inhibitor组，mimic组和inhibitor组分别通过Lipofectamine 2000转染50 nM 的miR-15b mimic或者inhibitor来上调或抑制miR-15b的水平。……