潘会君，朱聪聪，张欢欢，朱全刚，4

(1.上海市皮肤病医院，上海 200443；2.河南中医药大学，河南郑州450046；3.河南中医药大学第三附属医院，河南 郑州 450008；4.同济大学附属皮肤病医院，上海 200443)

重楼ParidisRhizoma为百合科植物云南重楼Paris poly phylla Smith var.yunnanensis(Franch.)Hand.－Mazz.或七叶一枝花Paris polyphylla Smith var.chinensis(Franch.)Hara的干燥根茎，有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊的功效，常用于疔疮痈肿，咽喉肿痛，蛇虫咬伤，跌扑伤痛，惊风抽搐等.重楼是重要的中药材资源，近年来重楼的抗肿瘤、抗氧化、抗菌等药理作用逐渐受到关注[1－2]，重楼皂苷的抗肿瘤作用被广泛报道，重楼皂苷能明细抑制乳腺癌细胞4T1增殖，迁移[3]，其中重楼皂苷Ⅰ的抗肿瘤作用研究报道较多.重楼皂苷I的抗肿瘤作用与细胞周期阻滞、诱导细胞凋亡、诱导自噬、抗血管生成、使肿瘤对化疗敏感、参与炎症和免疫反应的调节相关[4].

黑色素瘤是一种来源于转化黑素细胞的恶性肿瘤，发病率在全球范围内持续上升[5].黑色素瘤的致命性更强，约占皮肤癌相关死亡病例的73%[6]，对常规的放化疗敏感性低，生物靶向药物会产生快速耐药使得黑色素瘤的预后未得到有效改善，患者平均生存期只有6～9个月[7].黑色素瘤尤其是转移性黑色素瘤的治疗目前仍没有很好的治疗手段，因此药物研发仍是转移性黑色素瘤的治疗的关键.

研究显示，重楼皂苷I能抑制人黑色素瘤细胞A2058、G361的增殖并能诱导其凋亡[8].然而重楼皂苷I对黑色素瘤的作用机制尚未完全阐明，因此本研究采用网络药理学技术和实验验证相结合，从系统药理学角度探究重楼皂苷Ⅰ对黑色素瘤的作用及潜在机制.

1 材料与方法

1.1 网络药理学

1.1.1 靶点收集

从Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，Coreminemecical(https://coremine.com/medical/)数据库检索重楼皂苷I的分子靶点.所有靶点统一在UniProt(https://www.uniprot.org/)上校正，转换成Homo sapiens的Official Gene Symbol.

1.1.2 黑色素瘤靶点的获取

以“melanoma”为检索词在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中进行检索，对获取的结果进行整合、收集蛋白编码的靶点.所有靶点统一在UniProt上校正，转换成Homo sapiens的Official Gene Symbol.

1.1.3 交集靶点及蛋白－蛋白相互作用(proteinprotein interaction，PPI)网络构建

将重楼皂苷I的作用靶点，黑色素瘤的靶点分别输入在线Venn分析工具(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)，并绘制Venn图，获得药物与疾病的共有靶点.将共有靶点导入STRING Version 11.0(https://string－db.org/)[9]，构建蛋白互作关系，并导出互作关系，格式为后缀名tsv的文件，将文件导入Cytoscape 3.7.2软件构建蛋白互作网络(PPI)网络.本研究采用最高等置信度(0.9)的相互作用关系.

1.1.4 核心靶点识别

利用Cytoscape 3.7.2软件构建PPI网络后，使用Network Analyzer插件分析网络节点的拓扑性质参数.网络节点的拓扑性质参数，包括度、介数中心度及接近中心性[10].研究认为，一个点的节点度(degree)为该网络度中位数的2倍或以上则定义为核心成分和靶点[11].

1.1.5 基因本体(GO)及京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析

利用 DAVID v6.8(https://david.ncifcrf.gov/)[12]在线分析工具对蛋白模块进行GO(Gene ontology)分析及KEGG通路富集.使用基迪奥生物信息绘图云平台(https://www.omicshare.com/tools/)对富集结果进行气泡图绘制.

1.1.6 构建KEGG网络

使用基迪奥生物信息绘图云平台的“kegg网络图”工具构建通路图网络，然后采用利用Cytoscape 3.7.2软件重建KEGG网络，使用Network Analyzer插件分析通路的拓扑性质参数.

1.2 实验验证

1.2.1 仪器

Heal Force HF151UV CO2培养箱，Heal Force HPsafe－1200LC生物安全柜(上海力申科学仪器有限公司)；低温高速离心机(Thermo scientific)；Spectra-Max M2酶标仪(美谷分子仪器(上海)有限公司)；倒置荧光显微镜(OLYMPUS IX53).

1.2.2 试剂

重楼皂苷I购自上海同田生物技术股份有限公司，纯度≥98%，批号:19091931)；CCK－8试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司，编号C0038；Annexin V－FITC细胞凋亡检测试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司，编号C1062L；DMEM，胰蛋白酶，胎牛血清购自Gibco公司.

1.2.3 细胞株

A375细胞，购自复蒙基因生物科技有限公司，来源人，组织来源皮肤恶性黑色素瘤，形态上皮样.

1.2.4 细胞培养

A375细胞用DMEM高糖培养液(含10%胎牛血清)培养，置37℃，5%CO2的培养箱中培养.

1.2.5 CCK－8法

收集对数期细胞，接种细胞于96孔板，每孔加入100μL约5000个细胞.37℃，5%CO2培养，细胞贴壁24 h，加入重楼皂苷I，5%CO2，37℃培养24 h，每孔加入10μL CCK－8溶液，继续培养30 min，酶标仪450 nm处测量各孔的吸光值(OD值).细胞活力(%)＝[(用药组OD值－空白组OD值)/(对照组OD值－空白组OD值)]×100%.

1.2.6 细胞形态观察

收集对数期细胞，接种细胞于96孔板，37℃，5%CO2培养，细胞贴壁24 h，加入重楼皂苷I孵育24 h.倒置显微镜观察细胞形态.

1.2.7 流式细胞仪检测凋亡细胞

取对数生长期A375细胞，按5×104/mL接种于6孔板中，每孔加细胞悬液2 mL，培养24 h，加入不同浓度重楼皂苷I孵育24 h，收集细胞，1000 r/min离心，弃上清液，PBS洗涤，收集细胞，在冰浴中避光进行如下操作:用试剂盒中结合缓冲液悬浮细胞，调节细胞为5×104/mL，加入Annexin－FITC和PI染色液，混匀后孵育15 min，于1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡.

1.2.8 统计学处理

采用SPSS 25.0统计软件进行数据统计，多组计量资料采用单因素方差分析，组内两两比较采用SNK法检验，P<0.05为差异有统计学意义.

2 结果

2.1 重楼皂苷I靶点

重楼皂苷I是重楼的皂苷成分之一，其结构式见图1.通过Pubchem，Coreminemecical数据库检索整理重楼皂苷Ⅰ的靶点，其中Pubchem获得81个靶点，Coreminemecical获得86个靶点，经合并去重获得117个靶点.

图1 重楼皂苷Ⅰ分子式Fig.1 Molecular formula of polyphyllin I

2.2 黑色素瘤靶点的获取

以“melanoma”为关键词检索GeneCards数据库.通过GeneCards数据库收集黑色素瘤蛋白编码靶点，获得5321个靶点.

2.3 潜在作用靶点

重楼皂苷I的靶点和黑色素瘤的靶点，共有104个交集，这些共同靶点为重楼皂苷I治疗黑色素瘤的潜在作用靶点(图2).

图2 重楼皂苷I治疗黑色素瘤的潜在作用靶点Fig.2 Potential therapeutic targets of polyphyllin I in melanoma

2.4 潜在作用靶点PPI网络及核心靶点

将获得的104个潜在作用靶点输入蛋白交互网站STRING进行蛋白相互作用网络构建，并将其结果导入Cytoscape3.7.2软件进行可视化，结果见图3.PPI网络中共有96个节点(去除8个独立节点)，507条边，节点大小和节点颜色根据degree值排序，degree值越大节点越大且颜色越深.

图3 重楼皂苷I治疗黑色素瘤的潜在作用靶点的PPI网络Fig.3 PPI network as a potential therapeutic targets of polyphyllin I in melanoma

通过Network Analysis分析，靶点的Degree的中位数8.5，大于中位数2倍的靶点有20个，分别为TP53，AKT1，STAT3，MAPK8，MAPK14，JUN，MAPK3，MAPK1，CTNNB1，MYC，RELA，PIK3CA，NFKB1，CCND1，EGFR，VEGFA，TNF，FOS，RB1，IL6，以上靶点为重楼皂苷Ⅰ治疗黑色素瘤的核心靶点，这些靶点与黑色素瘤的生长、发展、转移密切相关(表1).

表1 核心靶点的Degree值Table 1 Degree value of the core target

2.5 GO富集分析

对104个潜在作用靶点进行GO分析，根据P<0.01，生物过程(Biological process，BP)富集251条、细胞组分(Cellcomponent，CC)富集27条和分子功能(Molecularfunction，MF)富集40条.将基因GO本体条目按P从小到大排序后选取前20绘制BP、CC和MF的柱状图.

BP主要涉及负调控细胞凋亡、正调控基因表达、药物反应、正调控基因转录、细胞对缺氧的反应、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、应激反应、肽丝氨酸磷酸化、细胞增殖调控、激活MAPK等，见图4.

图4 重楼皂苷Ⅰ潜在作用靶点参与的生物过程Fig.4 Biological processes involved in potential targets of polyphyllin I

CC主要涉及核质、胞质溶胶、线粒体、细胞质、细胞核、蛋白质复合体、核染色质、细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、线粒体外膜、细胞表面等，见图5.

图5 重楼皂苷Ⅰ潜在作用靶点涉及的细胞组成Fig.5 Cell components involved in potential targets of polyphyllinI

MF主要涉及蛋白结合、MAP激酶活性、蛋白激酶活性、转录因子结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、酶结合、激酶活性、染色质结合等，见图6.

图6 重楼皂苷Ⅰ潜在作用靶点参与的分子功能Fig.6 Molecular functions involved in potential targets of polyphyllinI

2.6 KEGG通路富集

对104个潜在作用靶点进行KEGG通路富集，根据P<0.01得到96条KEGG通路.涉及癌症，如癌症通路、癌症中的蛋白多糖等；信号转导，如FOXO信号通路、TNF信号通路、PI3K－Akt信号通路；免疫系统，如Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、T细胞受体信号通路等.将KEGG通路按P<0.01从小到大进行排序后选取前20排名的通路绘制气泡图，见图7.从KEGG通路富集结果分析，重楼皂苷I与癌症通路密切相关，并且也富集到黑色素瘤通路，见图8.

图7 重楼皂苷Ⅰ潜在靶点富集的KEGG通路Fig.7 KEGG pathways involved in potential targets of polyphyllin I

2.7 KEGG通路网络图

为了理解KEGG通路之间的关系，对富集到的96条KEGG通路进行网络构建，并进行通路的拓扑性质分析，其中MAPK信号通路，PI3K－Akt通路，凋亡，细胞周期，p53信号通路，Jak－STAT信号通路，TOLL样受体信号通路，mTOR信号通路，NF－kappa B信号通路，癌症通路连接度较高，关系密切，发挥着重要调控作用；其中黑色素瘤与MAPK信号通路，PI3K－Akt通路，细胞周期，p53信号通路关系最为密切，见图8和表2.

表2 KEGG通路网络拓扑分析Table 2 Topological analysis of KEGG pathways network

Pathways in cancer 4614 Human Diseases Cancers Viral carcinogenesis 2013 Human Diseases Cancers Wnt signaling pathway 1213 Environmental Information Processing Signal transduction Focal adhesion 1712 Cellular Processes Cellular community Hepatitis B 3511 Human Diseases Infectious diseases Epstein－Barr virus infection 2410 Human Diseases Infectious diseases T cell receptor signaling pathway 1910 Organismal Systems Immune system RIG－I－like receptor signaling pathway 1410 Organismal Systems Immune system ErbB signaling pathway 1410 Environmental Information Processing Signal transduction VEGF signaling pathway 1110 Environmental Information Processing Signal transduction Insulin signaling pathway 1310 Organismal Systems Endocrine system

图8 重楼皂苷I的KEGG通路网络图Fig.8 KEGG pathways network of polyphyllin I

2.8 重楼皂苷I对黑色素瘤A375细胞增殖的影响

重楼皂苷I不同浓度处理A375细胞24 h，随着浓度的增加细胞活力逐渐下降，且呈剂量依赖性，见图9.

图9 重楼皂苷I对黑色素瘤A375细胞增殖的影响Fig.9 Effects of polyphyllin I on the proliferation of A375 cells

2.9 重楼皂苷I对黑色素瘤A375细胞形态的影响

重楼皂苷I作用于A375细胞24 h，倒置显微镜观察细胞形态，随着重楼皂苷I浓度的加大，细胞体积缩小变圆，细胞减少，见图10.

图10 重楼皂苷I对黑色素瘤A375细胞形态的影响Fig.10 Effects of polyphyllin I on morphology of A375 cells

2.10 流式细胞仪检测细胞凋亡率

AnnexinV/PI双 染 法结 果 显 示，0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L重楼皂苷I促进A375细胞凋亡，随着重楼皂苷I剂量的增大A375细胞凋亡明显增多，见图11.

图11 重楼皂苷I对黑色素瘤A375细胞凋亡的影响Fig.11 Effects of polyphyllin I on apoptosis of A375 cells

3 讨论

重楼皂苷I对多种肿瘤细胞具有抑制作用，但对于黑色素瘤的研究较少.本研究以网络药理学为基础系统分析重楼皂苷I治疗黑色素瘤的特征分子机制，结合细胞实验验证，揭示重楼皂苷I治疗黑色素瘤的潜在分子靶点及信号通路.

通过网络药理学发现重楼皂苷I的分子靶点与黑色素瘤靶点有104个重合，进一步分析发现TP53，AKT1，STAT3，MAPK8，MAPK14，JUN，MAPK3，MAPK1，CTNNB1，MYC，RELA，PIK3CA，NFKB1，CCND1，EGFR，VEGFA，TNF，FOS，RB1，IL6为重楼皂苷I治疗黑色素瘤的核心靶点，这些靶点与黑色素瘤的生长、发展、转移密切相关.

生物过程富集发现重楼皂苷I具有调控细胞凋亡、调控基因表达、药物反应、正调控基因转录、细胞对缺氧的反应、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、应激反应、肽丝氨酸磷酸化、细胞增殖调控、激活MAPK等；分子功能涉及蛋白结合、MAP激酶活性、蛋白激酶活性、转录因子结合、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性、酶结合、激酶活性、染色质结合等；KEGG通路涉及癌症通路、FOXO信号通路、Toll样受体信号通路、TNF信号通路、NOD样受体信号通路、T细胞受体信号通路等.进一步的KEGG通路网络分析发现，MAPK信号通路，PI3K－Akt通路，凋亡，细胞周期，p53信号通路，Jak－STAT信号通路，TOLL样受体信号通路，mTOR信号通路，NF－kappa B信号通路，癌症通路连接度较高，表明这些通路关系密切；其中黑色素瘤通路与MAPK信号通路，PI3K－Akt通路，细胞周期，p53信号通路关系最为密切.

我们的细胞实验显示重楼皂苷I能抑制A375细胞的增殖，并且能促进其凋亡.Long J等[13]的研究表明重楼皂苷I具有抑制黑色素瘤细胞增殖，并能促进细胞凋亡，调控细胞周期，并且促进细胞自噬，对p－PI3K，p－AKT，and p－mTOR有明细抑制作用.Long J等重楼皂苷I促进细胞凋亡的实验结果与我们的一致.网络药理学预测结果显示重楼皂苷促进细胞凋亡，调控细胞周期及自噬.

进一步对重楼皂苷I抗肿瘤的文献进行回顾，我们发现重楼皂苷I通过STAT3/HOTAIR信号通路抑制EZH2诱导肺癌细胞周期阻滞和凋亡[14]；部分通过激活FOXO3信号传导途径对膀胱癌发挥抗肿瘤活性[15]；通过触发G2/M细胞周期阻滞来抑制HepG2细胞增殖和生长，并通过细胞内和细胞外凋亡途径诱导细胞凋亡，从而通过产生活性氧而导致细胞死亡[16]；直接AMPK激活剂的作用，调节HOTAIR和c－Jun表达，诱导细胞自噬，从而抑制非小细胞肺癌NSCLC细胞的生长[17－18]；诱导急性白血病THP－1和NB4细胞凋亡及自噬，并且与激活JNK信号通路有关[19].因此，重楼皂苷I具有广泛的抗肿瘤作用，其作用与细胞凋亡，细胞自噬，细胞周期等密切相关，其抗肿瘤机制与PI3K－Akt通路，Jak－STAT信号通路，FOXO3信号通路有关.

网络药理学提示重楼皂苷I对黑色素瘤的作用是干预多条信号通路的结果，其中PI3K－Akt通路已经通过实验得到了验证.重楼皂苷I影响其他信号通路从而发挥治疗黑色素瘤的作用为下一步研究提供了依据.