艾丹，智慧*，张鑫，杨秀华，斯琴格日乐

(1.呼伦贝尔职业技术学院，内蒙古 呼伦贝尔 021000；2.呼伦贝尔市动物疫病预防控制中心，内蒙古 呼伦贝尔 021000)

0 引言

小白蒿蒙名阿给，为菊科蒿属植物冷蒿Artemisia frigida Willd.的地上部分，其味苦，主治各种出血、痈疮、关节肿痛、劳肺病、月经不调等常见疾病[1,2]，是蒙古族常用药用植物。小白蒿在内蒙古境内分布集中[3]，广泛分布在草原带和荒漠草原带，多生长在砂质、沙砾质土壤上。查阅相关参考文献，小白蒿中主要含有黄酮类、倍半萜内酯类、苯丙素类化合物，绿原酸为其主要化学活性成分[4]。王青虎等[5]对小白蒿中的挥发性成分进行了气相色谱法指纹图谱研究，但目前未发现蒙药材小白蒿化学成分系统的指纹图谱研究，为了更好的开发小白蒿的药用价值，本研究以呼伦贝尔地区的小白蒿作为研究对象，采用高效液相色谱法，建立了呼伦贝尔地区不同产地小白蒿的指纹图谱，对不同来源的小白蒿药材进行了比较研究，为其质量控制和更好的开发利用提供参考。

1 实验材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪：日本岛津LC-15C输液泵、SIL-10AF自动进样器、CTO-15C紫外检测器、SCL-10AVP工作站；RJTGL-16G高速离心机(无锡市瑞江分析仪器有限公司)；SB-5200DT超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；BSA124S电子天平(Max=120g，d=0.1mg)赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.2 药品与试剂

绿原酸标准品(纯度≥98%，北京北纳创联生物技术研究院，批号： 190104)，乙腈为色谱纯(天津市科密欧化学试剂有限公司)、甲醇为色谱纯(山东禹王和天下新材料有限公司)，水为超纯水。

小白蒿药材由呼伦贝尔学院生命与环境科学学院黄学文教授鉴定为菊科艾属植物冷蒿(Artemisia frigidaWilld.)，来源及采收时间见表1。

表1 呼伦贝尔地区不同产地小白蒿编号和来源

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Diamonsil C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为乙腈(B)-0.1%磷酸溶液(A)，进行梯度洗脱，洗脱程序见表2。流速1.0mL/min，柱温40°C，检测波长为327nm，进样量10μL，记录时间60min。

表2 梯度洗脱流动相比例

2.2 供试品溶液的制备

精密称定小白蒿粉末0.5g，置250mL锥形瓶中，加入75%甲醇100mL浸泡隔夜，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用75%甲醇补足减失重量，离心过滤，精密量取续滤液10mL，置25mL棕色容量瓶中，加75%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸对照品0.0051g，置棕色容量瓶中，用50%的色谱甲醇稀释至刻度，制成0.116mg/mL的溶液，即得。

2.4 测定方法

精密吸取对照品和供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。用“中国色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会，2004A版)”进行数据处理，得到可全面反映多个色谱图特征的对照色谱。

2.5 方法学考察

2.5.1 仪器精密度考察

精密称取小白蒿粉末0.5g，按照“2.2”项的方法制备供试品，按照“2.1”项的方法进样，连续进样6次，考察各峰相对保留时间、相对峰面积及RSD值。结果显示共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均<2%，表明实验仪器精密度良好。

2.5.2 重复性考察

精密称取同一小白蒿样本6份，按照“2.2”项的方法制备供试品，按照“2.1”项的方法进样，考察各峰相对保留时间、相对峰面积及RSD值。结果显示共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均<2%，表明该试验方法重复性良好。

2.5.3 稳定性考察

精密称取小白蒿粉末0.5g，按照“2.2”项的方法制备供试品，分别于0，2，4，8，12，24h按“2.1”项的方法进样，考察各峰相对保留时间、相对峰面积及RSD值。结果显示共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD均<2%，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.6 指纹图谱的建立

将10批小白蒿药材，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按照“2.1”项的方法进样，记录色谱图，采用中国色谱指纹图谱相似度评价系统(国家药典委员会，2004A版)软件对指纹图谱的相关参数进行自动匹配，系统依据小白蒿药材的共有模式，生成对照指纹图谱，见图1。相似度分析结果见表3。保留时间7.8min的3号色谱峰与绿原酸对照品色谱峰保留时间一致，见图2，故选3号色谱峰作为参照峰，对10批药材的指纹图谱进行考察，确定了16个共有峰，见图3，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表4和表5。

表3 10批小白蒿药材相似度分析结果

表4 小白蒿药材指纹图谱共有峰相对保留时间

表5 小白蒿药材指纹图谱共有峰相对峰面积

图1 呼伦贝尔地区不同产地蒙药小白蒿共有模式指纹图谱

图2 绿原酸对照品溶液的色谱图

图3 呼伦贝尔地区不同产地蒙药小白蒿HPLC指纹图谱

3 讨论

本研究在文献分析的基础上，对呼伦贝尔地区蒙药材小白蒿的高效液相色谱指纹图谱进行了研究，考察了50%甲醇，75%甲醇，甲醇几种提取溶剂，采取了不同的浸泡时间之后超声，结果以75%甲醇浸泡隔夜后超声30min，所得提取液得到的色谱峰数量多、峰面积差异不大，提取方法简单，成本较低，确定了小白蒿药材适宜的样品前处理方法。考察了254nm，274nm，327nm3个波长对供试品溶液进行测定，显示327nm下色谱信息丰富，基线较为平稳，故选择327nm为检测波长。考察流动相时，比较了乙腈-0.4%磷酸水体系，乙腈-0.2%磷酸水体系，乙腈-0.1%磷酸水体系，结果表明使用乙腈-0.1%磷酸水体系洗脱时色谱峰分离效果较好，通过实验确定了合适的梯度洗脱程序。

指纹图谱已成为国际公认的控制天然药物质量的最有效手段[6]。目前对蒙药材小白蒿的研究多数集中在化学成分[7]及药理活性[8,9]。本实验利用高效液相色谱法将呼伦贝尔地区10个产地的小白蒿进行比较，通过实验分析发现，其中9个产地的小白蒿药材的相似度在0.8以上，说明各产地之间化学成分种类基本一致，但各色谱峰的相对峰面积还有一定的差异，S6相似度较低，为0.644，可能受产地影响，还应在大量收集样本的基础上对小白蒿药材进行深入研究，以期从药材整体特征和特有成分规范小白蒿药材。

本研究建立了呼伦贝尔地区蒙药材小白蒿的指纹图谱，标定出16个共有峰，可评价呼伦贝尔地区小白蒿药材的内在质量，从而为其资源现代化开发利用和综合质量评价提供科学依据。