潘 晶,杨 墨,黄琳丽,佟德利,邱 雨,陶婷婷,杜小丽,夏语擎,高 蕊

(沈阳师范大学 生命科学学院,沈阳 110034)

0 引 言

秸秆是最为常见的农业废弃物,其富含碳、氮、磷、部分微量元素和有机质[1]。在农业生产发展初期,秸秆除了用于堆沤肥、作为饲料喂养牲畜外,大多数秸秆作为日常生活中的燃料。随着生产力水平的进一步提高,能源利用也不断地更新换代,煤炭、天然气能源代替秸秆燃烧,高效的化学肥料取代了以秸秆为原料的生物肥料。目前,全世界农作物秸秆年产量超过2.0×1010t[2],我国作为农业大国,各种农业秸秆资源丰富,产量位于世界首位。最新报道表明,中国农作物秸秆年产量约为7×109t左右,其中玉米秸秆占28.6%,年产量高达2×109t。但是,随着秸秆产量不断增加,农村能源结构变化和各种替代原料的应用,又因为秸秆的分布零散、占地面积大、收集运输成本高、综合利用经济效益差、产业化利用程度低等,我国秸秆资源长期处于高消耗、高污染、低利用、低产出的状况,大量的农作物秸秆被弃置或者被野外焚烧,没有得到有效合理的利用,既造成了严重的生态环境污染和资源浪费,又使土壤有机质大量损失。秸秆是土壤重要的有机肥来源,合理的秸秆还田能够改善土壤结构,增加土壤肥力、有机质和微生物数量,调节土壤酶活性和生物活性,改善农田生态环境,增加农作物产量和品质[3-4]。秸秆还田是秸秆利用方式中最经济和环保的,不仅避免了资源的浪费,解决了秸秆带来的环境污染问题,还可以实现秸秆资源的循环利用及农业可持续发展[5-6]。秸秆还田主要有深埋还田和覆盖还田2种方式。深埋还田使秸秆的营养物质全部保留在土壤中,从而可以提高土壤的肥力,减少病虫危害。覆盖还田虽然能增强土壤的有机质,减少土壤水分的蒸发,但易造成水资源浪费,并影响播种。开展秸秆还田相关研究是贯彻党中央有关“推进种养业废弃物资源化利用”等政策的具体行动,是解决农村生态环境脏乱差、建设社会主义美丽新乡村的关键环节,也是实现经济新常态、促投资、稳增长的重要举措。

秸秆还田方式是影响土壤微生物群落结构、酶活性的重要因素[7-10]。本文研究了不同秸秆还田方式在玉米生长的不同阶段土壤对主要微生物的数量、土壤酶活性和细菌群落结构、多样性的影响。本研究能够为农业的可持续发展奠定理论基础,为秸秆综合利用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 实验地点概述

本实验以沈阳师范大学实验田(41°90′ N,123 °40′ E)为研究对象。该地区冬季寒冷干燥,夏季高温多雨,属于北温带大陆性季风气候区。土壤的理化特性:土壤有机质含量为15.60 g·kg-1,土壤全氮含量为l.00 g·kg-1,土壤全磷含量为0.52 g·kg-1,有效磷含量为8.40 mg·kg-1,土壤有效钾含量为98.30 mg·kg-1,土壤pH值多为6.39。

1.2 实验设计

探究秸秆对土壤微生物及酶活性的影响实验中,设置3组实验,空白对照组为不添加秸秆(DZT),实验组为秸秆覆盖于土壤表面(BMT)和秸秆深埋(20 cm)于土壤(SMT),秸秆还田量均为0.3 kg/m2。辽单352玉米秸秆经自然风干,粉碎成3～4 cm后,用于还田实验。在3组处理的土壤中分别播种玉米(辽单352),采用大垄双行种植方式,每次处理小区5行。按照获得玉米最高产量时的最佳密度和施肥量进行播种。玉米整个生育期内,按照高产田实施田间管理(密度为5～6株/m2,生长期施用氮肥0.2～0.3 kg/m2,磷肥0.01～0.02 kg/m2,钾肥0.01～0.02 kg /m2)。分别在玉米生长的6个阶段(苗期V3,拔节期V6,大喇叭口期V12,抽雄期VT,乳熟期R3,成熟期R6)取根际土,每个土样重复取3次,将其放入无菌袋中保存备用。在玉米收获后,采用多点混合法在土壤深度为0～20 cm处进行采样,将混合后的土样放于无菌袋中,用于研究玉米秸秆还田方式对土壤细菌群落结构及多样性的影响。

1.3 实验方法

土壤细菌、真菌和放线菌分别采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马丁氏培养基和高氏一号培养基。硝化细菌采用改良斯蒂芬逊培养基,氨化细菌采用牛肉膏蛋白胨培养基,好气性纤维素分解菌采用赫奇逊氏培养基,好气性固氮菌采用改良阿须贝氏培养基[9]。微生物数量以每克干土中的菌落数(CFU/g干土)表示。每克土壤样品的菌落数=同一个稀释度几次重复的菌落平均数×稀释倍数×10。

土壤转化酶的测定采用3,5-二硝基水杨酸比色法(DNS),土壤脲酶采用尿素残留法,过氧化氢酶采用高锰酸钾滴定法。

土壤细菌群落结构及多样性由杭州联川生物技术有限公司完成。土壤样品上机测序完成后,原始的下机数据,利用overlap将双端数据进行拼接,利用质控、嵌合体过滤,获得高质量的Cleandata。DADA2(divisive amplicon denoising algorithm)通过“去重复”(dereplication,相当于以100%相似度聚类)等步骤获得单碱基精度的代表序列。然后使用ASVs(amplicon sequence variants)的概念构建类OTU(operational taxonomic units)表,获得最终的feature特征表以及特征序列,进一步进行细菌多样性分析和物种分类注释等。

实验数据采用Excel 2010和SPSS 18.0进行处理。

2 结果与分析

2.1 土壤主要微生物数量

土壤中的细菌及降解性微生物作为土壤养分循环和物质转化的主要动力,能够增加氮、磷元素的含量,进而可以改善土壤的肥力状况[11-12]。由表1可以得出:生长发育前期(苗期V3到大喇叭口期V12),BMT和SMT中细菌数量与DZT的无显著差异;在生长发育后期(抽雄期VT到乳熟期R3),深埋还田根际土细菌数量更多。在玉米整个生长期中,BMT和SMT根际土细菌平均数量比DZT分别增加15%和30%以上。

表1 秸秆还田方式对主要土壤微生物数量的影响(CFU/g干土)Table 1 Effects of straw returning on microbial quantity

玉米秸秆还田使根际土真菌数目减少,在生长后期,真菌数量受影响更加严重。从抽雄期VT直到成熟期R6,SMT根际土壤中真菌数量比BMT下降超过20%。这可能是由于在深埋还田处理中细菌和放线菌成为优势菌种,抑制了真菌数量的增加。

秸秆还田增加了土壤放线菌数量,SMT放线菌平均数量增幅要高于BMT,在V12～R6内,SMT的土壤放线菌平均数量比BMT的增加40%以上,比DZT增加43%以上。

2.2 土壤主要微生物生理类群数量

微生物是土壤生态系统的关键,其数量及活性直接影响有机物的降解速率和土壤肥力。不同玉米秸秆还田方式下,土壤主要微生物生理类群数量如表2所示。在玉米整个生长期内,秸秆还田增加了土壤中好气性固氮菌、土壤氨化细菌、硝化细菌和好气性纤维素分解菌数量;SMT好气性固氮菌平均数量比BMT增加59%,土壤氨化细菌数量比BMT增加70%。在VT～R6内,SMT硝化细菌和好气性纤维素分解菌的数量都高于BMT。

表2 秸秆还田方式对土壤微生物生理类群的影响(CFU/g干土)Table 2 Effects of straw returning on soil microbial physiological groups

2.3 土壤酶活性

脲酶能够水解尿素生成铵态氮,从而被植物根系吸收利用,脲酶的活性可以用来表征土壤中氮素的营养状况;过氧化氢酶在一定程度上对土壤有机质造成影响;转化酶在土壤碳循环中起重要作用,能将蔗糖转化成葡萄糖和果糖。从表3中能够得出,秸秆还田提高了土壤脲酶、过氧化氢酶和转化酶活性。在玉米的整个生长期中,SMT和BMT土壤脲酶活性比DZT分别增长65.83%和27.65%;转化酶活性分别增加21.04%和12.64%;过氧化氢酶活性分别增加13.22%和9.62%。

表3 秸秆还田方式对土壤酶活性的影响Table 3 Effects of straw returning on soil enzyme activity

2.4 细菌群落结构及多样性

2.4.1 细菌OUT及Alpha多样性分析

测序获得序列归类,在97%的相似度水平下,聚类得到各样品OTU个数。从图1可知,3组样品一共获得4 245个OUT;OTU个数为DZT>SMT>BMT;3组样品共同OTU为578个,DZT特有OTU 1659个,SMT为882个,BMT为466个。

图1 细菌Venn图Fig.1 Bacterial Venn Chart

Alpha多样性指数值中Chao1和Shannon指数均指示群落结构变化。Alpha多样性指数值中Shannon指数对物种丰富度更敏感。从表4可知:3组样品的Shannon指数,DZT>SMT>BMT;3组样品的Chao1指数,DZT>SMT>BMT。说明DZT土壤细菌种群较多,物种较为丰富。

表4 Alpha多样性指数Table 4 Alpha diversity index

2.4.2 细菌物种分析

从图2可知,3组样品门水平优势属共9个,分别为变形菌门(proteobacteria)、放线菌门(actinobacteria)、未知菌门(unclassified)、膝状菌(genmmatimonadetes)、pates-cibacteria菌门、酸杆菌门(actidobacteria)、拟杆菌门(bacteroidetes)、绿弯菌门(chloroflexi)、浮霉菌门(planctomycetes)。秸秆深埋和表面覆盖还田,降低了变形菌门、放线菌门、未知菌门和绿弯菌门相对丰度。秸秆深埋和表面覆盖还田,增加了放线菌门、patescibacteria菌门和浮霉菌门(planctomycetes)相对丰度。

细菌门水平的热图分析如图3所示。在没有秸秆还田的土壤中(DZT),dependentiae,verrucomicrobia,spirochaetes,omnitrophicaeota,FCPU426,latescibacteria,fibrobacteres,WS2,proteobacteria,armatimonadetes和acidobacteria多样性均较高;秸秆深埋还田的土壤中(SMT),planctomycetes多样性较高;秸秆表面覆盖还田的土壤中(BMT),OD1和genmmatimonadetes多样性较高。

图3 土壤样品细菌热图分析Fig.3 Bacterial thermogram analysis

3 结 论

玉米秸秆深埋还田的土壤细菌、放线菌的数量明显高于秸秆覆盖还田。在玉米整个生长期内,秸秆还田增加了土壤中好气性固氮菌、土壤氨化细菌、硝化细菌和好气性纤维素分解菌数量;增加了土壤脲酶活性、转化酶活性和过氧化氢酶活性,并且3种酶活性增加高于秸秆覆盖还田;降低了土壤细菌的多样性,改变了耕作层细菌的分布结构;降低了变形菌门、放线菌门、未知菌门和绿弯菌门相对的丰度,增加了放线菌门、patescibacteria菌门和浮霉菌门(planctomycetes)的相对丰度。由上可知,秸秆深埋还田有效地增加了土壤细菌、放线菌的数量,增加了土壤酶活性,从而有利于玉米的生长。

致谢感谢沈阳师范大学重大孵化项目(ZD201904)和沈阳师范大学大学生创新创业项目(202106020,202106026,202106027)的支持。