叶佩灵， 嘉红云， 彭 亮

1 广州医科大学附属第二医院 检验科， 广州 510260； 2 广州医科大学附属第五医院 检验科， 广州 510700

在我国，肝癌是仅次于肺癌的第二大恶性肿瘤，中国占全球发病人数的47%[1]。肝癌的发病原因尚未明确，以发展快、疗效差和复发率高为特征，极易发生肝内和肝外转移，预后差，5年生存率不足30%。近年来，大量研究发现高尔基体磷蛋白2/高尔基体蛋白73(golgi phosphoprotein 2，GOLPH2/GP73)的高表达与肝脏疾病有一定的关系[2-3]，尤其与原发性肝癌关系密切，人们逐渐认识到GP73有可能成为肝癌早期诊断的标志物[4-5]，血清GP73可预测肝细胞癌患者肝切除术后的预后[6]。研究[7]还发现，有效干扰GP73基因表达后，可明显抑制人肝癌细胞的迁移和侵袭能力，GP73的表达可能与肿瘤的发生发展相关。目前关于GP73通过何种信号通路参与肝癌的发生发展的研究较少，为进一步阐明GP73对肝癌的作用机制，本实验建立了干扰和过表达GP73的Hep3B肝癌细胞模型，采用转录组测序检测不同GP73表达量的肝癌细胞中mRNA表达谱的差异，并进行生物信息学分析，旨在筛选出GP73参与调控肝癌相关的信号通路，进而为肝癌发病机制的探索提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器 Hep3B细胞株购于广州赛库生物技术有限公司；GP73、GAPDH一抗购于Proteintech公司；PI3K、p-AKT和AKT抗体购于CST公司；pcDNA3.1过表达质粒、阴性对照质粒由安徽通用生物科技有限公司提供；干扰片段引物设计、合成和测序由吉玛生物公司完成；文库构建试剂盒(NGS00-2013，中国依科赛)；Trizol(TR118-500，MRC)；qRT-PCR试剂盒(Q341-03，Vazyme)，GP73、内参GAPDH引物、实时定量PCR引物由捷瑞生物公司合成。PCR仪(StepOne Plus，美国ABI公司)；Illumina 测序平台(HiSeqTM2000)；生物分析仪(Agilent2100，中国Agilent公司)。

1.2 实验分组 肝癌细胞Hep3B分为4组进行培养，分别是GP73干扰组:Hep3B+si-GP73；干扰对照组:Hep3B+siRNA NC；GP73过表达组:Hep3B+pcDNA3.1-GP73；过表达对照组:Hep3B+pcDNA3.1。

1.3 重组质粒的转染 细胞消化后，接种至6孔板中，37 ℃、5%CO2培养箱中培养过夜。把转染试剂分别与干扰片段siRNA-GP73、过表达质粒pcDNA3.1-GP73混匀，形成DNA脂复合物，滴加至细胞培养皿中继续培养，干扰片段和过表达质粒通过融合或细胞内吞进入细胞，48 h后提取细胞总RNA, 进行cDNA 逆转录。qRT-PCR和Western Blot验证GP73mRNA的量，干扰组和过表达组GP73 mRNA的量与对照组比较有显著差异，转染成功。qRT-PCR反应条件：95 ℃ 120 s热变性；变性95 ℃ 15 s、退火延伸60 ℃ 30 s，反应40个循环；溶解曲线60～95 ℃。GP73、内参GAPDH引物由捷瑞生物公司合成，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列表

1.4 文库构建和测序 转录组测序及生物信息学分析由永诺生物科技有限公司完成。从样本中提取总RNA，以磁珠富集真核生物mRNA；mRNA经打断后以随机引物

合成一链cDNA，再合成二链cDNA。纯化后的双链cDNA经末端修复，再连接接头。以磁珠对连接产物进行片段选择并进行PCR扩增纯化回收。cDNA文库经Agilent 2100 生物分析仪检测，qPCR定量后以Illumina HiSeqTM2000测序仪进行测序。

1.5 测序数据处理和功能富集分析 测序所得的数据，根据筛选条件(P≤0.05并且|log2Ratio|≥0.59)从不同组别中筛选差异表达的mRNA，得到受GP73调控的基因。应用超几何检验，GO分析通过与Gene Ontology数据库比较，得到显著富集的GO条目，从而推断GP73参与的生物学功能。KEGG分析通过与全基因组比较，获得受GP73调控的信号通路。

1.6 Western Blot验证测序结果 采用Western Blot验证不同组别GP73和信号通路蛋白表达量的变化。经SDS-PAGE电泳后，将目标蛋白转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭，加入一抗，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜2次，加入HRP标记二抗，室温孵育1～2 h，TBST洗膜3次后进行化学发光显影。使用图像处理软件Image J分析目标条带的光密度值。以GAPDH作为内参照，对结果进行定量分析。

1.7 统计学方法 采用Graphpad 7.0软件对数据进行统计学分析，不同实验组间进行差异分析，符合正态分布的计量资料2组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 测序数据评估 为保证信息分析质量，对Hep3B4组细胞的cDNA文库基因测序得到原始序列(Raw Reads，总计18.3×107个)，经过滤和质控，得到高质量的测序数据(Clean Reads，18.0×107个，占原始序列的98.36%)。4组样品的测序数据差异较小，碱基质量值大于20和30的碱基占总体碱基比例分别为Q20≥97.54%，Q30≥93.26%，表明测序结果较好。

2.2 根据测序数据筛选差异表达基因 cDNA文库测序分析显示GP73干扰组、过表达组和对照组测到的共同基因有15 147个(图1)。运用软件SOAP根据筛选条件(P≤0.05并且|log2Ratio|≥0.59)对 mRNA表达量进行比较分析，结果显示：干扰GP73后，差异表达基因一共有1508个，其中表达升高的有327个，表达下降的有1181个；过表达GP73后，差异表达基因一共有731个，其中表达升高的有361个，表达下降的有370个(图2、3)。在GP73干扰组和过表达组相同的差异表达基因一共有60个，在干扰组中表达下降以及在过表达组中表达升高的有46个；在干扰组中表达升高以及在过表达组中表达下降的有14个(图4)。

图1 干扰和过表达GP73后4个组的差异表达基因交叉分布情况

图2 干扰和过表达GP73后干扰组与过表达组差异表达

注：横坐标表示对照组样品基因表达量(取对数)，纵坐标表示实验组样品基因表达量(取对数)。实验组样品相对于对照组样品，红点表示基因表达量上调的基因，绿点表示基因表达量下调的基因，蓝点表示基因表达量没有显著变化的基因。

图4 干扰和过表达GP73后共同差异表达基因的热图

2.3 差异表达基因mRNA功能分析和通路预测

2.3.1 GO功能富集分析 GO功能分析描述基因的3个部分：分子功能、细胞位置、生物过程。根据测序数据筛选满足条件的差异表达基因与人类基因组数据库进行比对，应用超几何检验。结果显示，显著富集的 GO条目一共有586条(P<0.05)，其中生物过程429条、分子功能88条、细胞位置69条。生物过程显著差异的前10个条目分别是：细胞过程、单个组织的过程、生物调节等条目(图5)，提示GP73可能通过这些生物学功能参与调控肝癌。

图5 差异表达mRNA排名前10位的GO分析富集条目

2.3.2 KEGG富集分析 将差异表达基因和全基因组进行比对，使用超几何检验，获得Hep3B干扰GP73和过表达GP73后差异表达基因显著富集的代谢通路。KEGG富集分析显示：在干扰组，266条信号通路被显著富集；在过表达组，227条信号通路被显著富集。在排名前17位的信号通路中有4个与肝癌密切相关，包括PI3K-AKT、细胞因子/细胞因子受体相互作用、TNF、JAK-STAT信号通路(图6)。结果提示GP73可能通过这些信号通路参与肝癌的调控。同时也发现了既往报道与肝癌相关的其他重要通路，例如Rap1、NF-κB等信号通路。

2.4 Western Blot验证PI3K-AKT信号通路 随机选取KEGG分析排名前10位的与肝癌密切相关的PI3K-AKT信号通路进行验证。通过Western Blot检测PI3K-AKT的3个蛋白PI3K、p-AKT和AKT的表达，比较干扰和过表达GP73后3个蛋白表达的差异。结果显示，干扰组蛋白PI3K、p-AKT表达量显著低于对照组(P值均<0.05)；过表达组蛋白PI3K、p-AKT表达量显著高于对照组(P值均<0.05)(图7)。Western Blot结果证实了KEGG分析对信号通路的预测，GP73可能是通过激活PI3K-AKT信号通路的相关信号分子PI3K、p-AKT蛋白参与肝癌的调控过程。

3 讨论

肝癌以病情进展快、疗效差和复发率高为特征，发病机制和病因尚不明确。寻找新的药物治疗靶点，成为研究的动力和方向。GP73是Kladney等[7]在2000年发现的一种Ⅱ型高尔基体膜蛋白，是定位于高尔基体顺面膜囊上的磷酸化跨膜蛋白。GP73在健康人肝细胞中很少表达，主要表达于胆管上皮细胞，在上皮细胞的多项病理及生理活动中发挥着重要作用。作者过往研究[8-10]发现，GP73在肝癌患者的血清和肝组织中表达异常升高。也有研究[11]发现，GP73可通过上调上皮间质转化促进人肝癌细胞的侵袭性。另外，GP73在转移性肝癌细胞中也有异常表达，有可能成为肝癌转移治疗的一个新的分子靶点[12]。目前，GP73如何参与肝癌发病过程的具体机制尚不明确，值得去探究。

注：纵坐标表示KEGG分析的条目，横坐标表示显著差异表达基因的比例，点的大小表示显著差异表达基因的数目，点的颜色代表显著性，表示不同的P值(0～1)。

注：*,P<0.05。

本文借助转录组测序技术为揭示GP73对肝癌的作用机制以及作为治疗肝癌的作用靶点进行研究。在本研究中，对肝癌细胞株Hep3B进行干扰和过表达GP73的处理，采用转录组测序分析，得到18.3×107个原始序列，分析显示4组样本共同检测到的基因有15 147个，根据筛选条件(P≤0.05并且|log2Ratio|≥0.59)，对4组样本的mRNA表达量进行比较分析，结果显示：干扰GP73后，差异表达基因一共有1508个，过表达GP73后，差异表达基因一共有731个，在干扰组和过表达组相同的差异表达基因一共有60个，其中在干扰组中表达下降以及在过表达组中表达升高的有46个；在干扰组中表达升高以及在过表达组中表达下降的有14个。对差异表达基因进行GO分析显示：显著富集的GO条目有586条，其中生物过程429条、分子功能88条、细胞位置69条。生物过程显著差异的前10个条目分别是：细胞过程、单个组织的过程、生物调节等条目，提示GP73可能通过参与这些生物学功能调控肝癌的发病过程。KEGG富集分析显示：在干扰组，266条信号通路被显著富集，在过表达组，227条信号通路被显著富集。其中，在排名前17位的信号通路中有4个与肝癌密切相关，包括PI3K-AKT、细胞因子/细胞因子受体相互作用、TNF、JAK-STAT信号通路，提示GP73可能通过这些潜在的信号通路参与肝癌的调控。随机选取KEGG分析排名前10位的与肝癌密切相关的PI3K-AKT信号通路进行验证，通过Western Blot检测PI3K-AKT的3个关键蛋白PI3K、p-AKT和AKT的表达。结果显示，干扰组PI3K、p-AKT的表达量显著低于对照组(P值均<0.05)；过表达组PI3K、p-AKT的表达量显著高于对照组(P值均<0.05)。Western Blot结果证实了KEGG分析对信号通路的预测，GP73可能是通过激活PI3K-AKT信号通路的相关信号分子PI3K、p-AKT蛋白参与肝癌的调控过程。

综上所述，通过转录组测序技术，发现GP73对肝癌发展的调控机制可能是通过PI3K-AKT、细胞因子/细胞因子受体相互作用、TNF、JAK-STAT等信号通路实现，提示GP73有可能成为肝癌治疗的新的分子靶点，笔者后续将继续在更多肝癌细胞系深入研究，验证其作用机制。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：叶佩灵负责资料分析，撰写论文；嘉红云、彭亮负责课题设计,指导文章撰写。