田 原, 徐 玲, 范子豪, 曹亚玲, 张向颖, 陈 煜, 段钟平, 任 锋

1 首都医科大学附属北京佑安医院， 北京市肝病研究所， 北京 100069； 2 首都医科大学附属北京佑安医院肝病中心四科， 肝衰竭与人工肝治疗研究北京市重点实验室， 北京 100069

HBV感染是影响全世界人民健康的主要公共卫生问题，有超过2.5亿的HBV感染者，每年因HBV感染所导致的死亡人数大约有88.7万[1-3]。目前，主要的抗病毒药物如核苷(酸)类似物和干扰素α等都不能完全治愈HBV，根本原因在于不能彻底清除共价闭合环状DNA(cccDNA)[4]。HBV cccDNA是病毒RNA复制转录的模板，它能以微染色体的形式长期稳定的存在于肝细胞核内[5]。因此，建立一种有效的检测HBV cccDNA方法，对于临床抗病毒治疗效果的评价和治疗策略的调整都具有重要意义[6]。本研究建立了检测HBV cccDNA的微滴数字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)方法。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2017年6月—2020年10月在本院就诊的20例临床诊断为HBV感染者的肝组织样本。质粒为本实验室构建的pUC-HBV质粒。

1.2 试剂与仪器 QIAamp DNA Mini Kit(50)购自德国QIA-GEN公司；Plasmid-safe ATP-dependent DNase购自美国Lucigen公司；TaqMan Fast Advanced Master Mix购自美国Applied Biosystems公司。新羿TD-1微滴式数字PCR仪购自新羿生物公司。ViiATM7 Real-Time PCR System荧光定量PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。

1.3 引物和探针的设计与合成 因为HBV cccDNA是完整的闭合环状DNA，而HBV松弛环状DNA(relaxed circular DNA，rcDNA)存在缺口，所以通过跨越HBV DNA负链缺口设计HBV cccDNA的上下游引物及探针(图1)。引物及探针序列，HBV cccDNA-F：5′-GGGGCGCACCTCTCTTTA-3′；HBV cccDNA-R：5′-AGGCACAGCTTGGAGGC-3′；HBV cccDNA-P：5′-FAM-TCACCTCTGCCTAATCATCTC-TAMRA-3′。

图1 HBV cccDNA与rcDNA结构示意图

根据Gene Bank中提供的β-actin基因序列设计上下游引物和探针，并在PubMed上进行引物序列的比对。引物及探针序列：β-actin-F：5′-ACTGTGCCCATCTACGAGG-3′；β-actin-R：5′-CAGGCAGCTCGTAGCTCTT-3′； β-actin-P：5′-FAM-CGGGAAATCGTGCGTGAC-TAMRA-3′。引物和探针由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 HBV cccDNA阳性对照质粒的建立 利用设计好的HBV cccDNA引物对HBV质粒扩增，然后纯化回收目的片段，用目的片段与T载体连接，转入JM109大肠杆菌中，再把大肠杆菌放入LB培养基中进行扩增，最后提取质粒。……