刘明君， 刘颖娟， 杨 桂， 刘松梅

武汉大学中南医院 检验科/基因诊断中心/检验系， 武汉 430071

肝细胞癌(HCC)是常见的消化系统恶性肿瘤之一，其恶性程度高，增殖能力强，患者预后差。2018年，全球新发肝癌84.1万例，在恶性肿瘤发病率排名第6位，死亡78.1万例[1]；2015年我国的新发肝癌约37.0万例，死亡人数约32.6万例[2]。因此，寻找肝癌预后评估的生物标志物具有重要的临床意义。

葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PD是参与磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway，PPP)的第一种酶，也是PPP的限速酶，糖酵解产生的6-磷酸葡萄糖在G6PD的催化下进入PPP，产生细胞活动所需要的能量[3]。研究发现，G6PD在黑色素瘤[4]、乳腺癌[5]、肺癌[6-7]、肝癌[8-9]、结直肠癌[10]等恶性肿瘤中表达升高，在肿瘤的发生发展中起重要作用。

淋巴细胞/单核细胞比值(LMR)是反映机体炎症和免疫状态的一项敏感指标，已被证实可用于预测卵巢癌[11]、肺癌[12]和肝癌[13]等实体肿瘤的预后。本文通过分析G6PD在肝癌组织中的表达与预后的关系，以及不同G6PD表达水平患者的临床指标差异，探讨G6PD表达在HCC预后评估中的临床价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象 收集2016年6月—2018年1月在本院就诊的44例首诊HCC患者的肝癌组织和相应的癌旁组织标本，及其临床信息和实验室检查结果。纳入标准：(1)所有患者均符合《原发性肝癌诊疗规范(2019年版)》[14]；(2)有完整的基本资料和实验室检测结果(肝肾功能、血常规、凝血指标和肿瘤标志物)。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤或有全身感染症状；(2)术前接受过其他方式治疗。

1.2 仪器试剂 采用贝克曼奥林巴斯5800 全自动生化分析仪检测肝肾功能，贝克曼库尔特全自动血细胞分析仪H750检测血常规。贝克曼ACLTOP检测凝血指标。BeckmanDX1800全自动化学发光仪测定AFP。BIO-RAD荧光定量 PCR系统CFX ConnectTM检测基因表达。

1.3 方法 使用Trizol(美国Thermo公司)提取组织RNA。逆转录试剂盒FSQ-301(日本TOYOBO公司)合成cDNA。β-actin为内参基因,进行qPCR。G6PD：上游5′-AACATCGCCTGCGTTATCCTC-3′,下游5′-ACGTCCCGGATGATCCCAA-3′；β-actin：上游5′-CCTCGCCTTTGCCGATCC-3′,下游5′-GGATCTTCATGAGGTAGTC AGTC-3′。

用Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)数据库分析G6PD在HCC组织中的表达。Kaplan Meier Plotter(KM plotter)数据库评估HCC组织中G6PD表达水平与预后。

1.4 伦理学审查 本研究方案经由武汉大学中南医院伦理委员会审批，批号： 2017058。

2 结果

2.1 肝癌组织中G6PD mRNA表达 运用RT-qPCR检测44例HCC患者肝癌组织和癌旁肝脏组织中G6PD的mRNA表达水平。结果发现，G6PD mRNA在癌组织中表达明显高于癌旁组织(Z=-3.221，P=0.001)，癌组织G6PD表达水平是癌旁组织的2.09倍(图1a)。

注：a， HCC患者癌组织和癌旁组织G6PD mRNA表达水平比较；b，GEPIA数据库中G6PD在肝癌组织中表达；c，G6PD高表达和低表达患者总生存曲线；d，G6PD高表达和低表达患者无进展生存曲线。

2.2 低G6PD组和高G6PD组的HCC患者基本资料 根据G6PD mRNA表达水平中位数，将患者分为G6PD高表达组(n=22)及低表达组(n=22)。两组患者在年龄、性别、HBV DNA检测阳性率和TNM分期上差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表1)。

2.3 肝癌患者预后与G6PD表达的关系分析 运用GEPIA数据库分析肝癌组织(n=369)和癌旁组织(n=160)中的G6PD表达。结果发现，G6PD在癌组织中表达明显高于癌旁组织(P<0.01)(图1b)。运用KM plotter数据库，分析两组患者预后差异。结果发现，G6PD高表达是不良预后的危险因素：总生存期(HR=1.84，95%CI： 1.30～2.61;P=0.000 52)和无进展生存期(HR=1.75，95%CI： 1.27～2.42；P=0.000 54)，即G6PD高表达患者预后不良(图1c、d)。

2.4 肝癌组织中G6PD表达与临床指标的关系 为了进一步比较肝癌患者中G6PD mRNA表达与临床指标的关系，比较HCC患者低G6PD组(n=22)和高G6PD组(n=22)的肝功能、血常规、凝血功能和AFP差异。

结果显示，LMR在高G6PD组患者中明显低于低G6PD组(P=0.011)，其他指标两组间差异均无统计学意义(P值均>0.05)(表2)。

表2 肝癌患者G6PD表达水平与术前临床指标关系

2.5 G6PD表达与LMR相关性分析 进一步分析G6PD mRNA表达量与LMR相关性，结果显示G6PD表达水平与LMR呈负相关(r=-0.439,P=0.005)(图2), 提示G6PD表达与免疫功能、炎症状态有关。

图2 G6PD mRNA表达与LMR相关性

3 讨论

HCC是一种进展迅速，恶性程度高，预后极差的肿瘤[15]。随着各种分子生物学层面的研究深入，越来越多的研究表明肝癌的发生发展常伴随着糖代谢紊乱[16]、多种基因表达改变和信号通路异常[17]。

肿瘤细胞由于瓦伯格效应(Warburg effect)主要通过糖酵解的方式分解葡萄糖获能，所产生的6-磷酸葡萄糖可以通过PPP为核苷酸、脂质等生物分子合成提供前体以及NADPH[16,18]。本研究发现G6PD基因在HCC中表达明显高于配对癌旁组织。相关研究指出，PI3K/Akt、Ras和Src等促癌信号通路的过度激活，可通过翻译后调控机制促进G6PD激活[3]，从而引起肿瘤组织中G6PD表达升高，产生的高水平NADPH可以减少细胞活性氧(ROS)的生成[19]。ROS在多种癌症中被检测到，一方面被认为可以激活肿瘤信号，但同时ROS累积也能启动氧化应激诱导肿瘤细胞的死亡，肿瘤细胞G6PD表达升高，可以减少升高的ROS，建立氧化还原平衡[20]。同时细胞内ROS累积会引起NF-κB的激活，可引起大量细胞因子如IL-6、IL-24、IL-32等的释放，细胞因子招募单核细胞、巨噬细胞到肿瘤部位，引起肿瘤微环境炎症反应，促进肿瘤发展[21]。

已经有研究证实HBV感染会引起G6PD的升高[22]，同时HBV感染可能会引起肿瘤微环境炎症反应，引起免疫细胞数量和状态改变[23]。而高LMR是多种癌症预后的保护因素[9,24]，在肝癌的相关研究[25]中，肝癌术前LMR可分为高值组(≥3.03)和低值组(<3.03)，高LMR组患者肝癌切除术后5年生存率较好。也有学者[26]指出肝移植术后LMR<2.75的患者的5年生存率明显低于LMR≥2.75的患者。而本研究发现LMR在G6PD高表达组中明显低于G6PD低表达组，且肝癌组织中G6PD表达水平与LMR呈负相关，提示G6PD高表达的HCC患者不良预后可能与肿瘤微环境炎症有关。

综上，在肝癌组织中高G6PD的表达与不良预后有关，G6PD高表达和低表达组的LMR有明显差异，且G6PD的表达量与LMR呈负相关，提示G6PD表达可能与肿瘤微环境炎症反应有关。本研究所用样本量较小，具体的分子机制尚需进一步研究。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员、受试者监护人以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：刘明君负责实验和数据分析，撰写论文； 刘颖娟参与收集数据，修改论文；杨桂、刘松梅负责课题设计，指导撰写文章并最后定稿。