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酵母的大分子营养需求与转运策略(Ⅰ)

2021-08-16俞丽燕章亭洲

饲料博览 2021年7期
关键词:氮源营养物质酵母菌

俞丽燕,章亭洲

(浙江科峰生物技术有限公司固态发酵与生物饲料研究院,浙江海宁314423)

酵母是在发酵工业中应用最为广泛的单细胞真核微生物,其培养物和提取物等酵母类产品也是一种绿色的饲料添加剂,在饲料工业中也有广泛的研究和应用[1]。同时,酵母中的酿酒酵母是研究真核生物的模式物种,对于理解真核生物细胞内在规律具有重要意义[2-4]。不管是在基础研究中,还是在应用研究中,酵母的培养都是非常关键的。从元素的水平来看,酵母所需营养元素与其他微生物类似,都是由大量元素和微量元素组成。但酵母在营养物质的需求、培养基组成成分和大分子营养物质的转运方式上都有其自身的特点。

酵母的营养涉及酵母细胞如何被培养的问题,更具体地说,它指的是酵母细胞如何将培养基中的各类营养物质转运至细胞内。膜运输是营养物质选择性吸收的关键,这是酵母细胞间相互作用和与周围环境相通最基本的途径。本文进一步讨论了酵母细胞各种膜转运机制。酵母的营养也指细胞用于生长和生存采取的合成代谢和分解代谢的基本营养物质来源。

了解酵母细胞的营养需求、获取方式以及营养物质运输,对实验室培养酵母细胞和工业发酵的优化具有重要意义。

1 酵母的大分子营养需求

对100 g面包酵母进行元素分析,可以得出以下“经验公式”:C47H6.3O33N8P1.2。由于酵母菌株和生长条件的差异,使得该方程式的变化较大,因而参考价值有限。但它仍对理解酵母细胞的营养构成具有一定帮助。

酵母细胞从生长环境中获取各类营养元素。表1中总结了酵母细胞对元素的需求。

表1 酵母常见营养元素需求

大多数酵母菌可以在pH值为5.5时由己糖、铵盐、各种矿物质、微量元素和少量维生素配置成的液体培养基中生长良好。然而,酵母细胞对营养的需求是多样化的,这种多样性将从酵母营养的化学来源来考虑。

1.1 碳

酵母菌是化能异养型微生物。这意味着它们从化合物的固定、有机物的化学键上获得碳和能量。

酵母利用各种糖类作为碳源,包括己糖和戊糖等单糖、二糖和多糖。除提供碳源外,这些糖类分解代谢时也为酵母提供能源。实验室中培养酵母最常使用的碳源是葡萄糖,但酵母在自然生境中能够获取的葡萄糖很少,通常利用纤维素、淀粉和其他多糖作为碳源。在工业发酵过程中,酵母利用麦芽糖、蔗糖、果糖和木糖等作为碳源。需要注意的是,葡萄糖能够抑制酵母对其他糖类的同化吸收。葡萄糖并不是所有酵母细胞代谢最有效的糖。在自然栖息地(聚合纤维素、淀粉等多糖)或在许多工业发酵基质(麦芽糖、蔗糖、果糖、木糖和乳糖是更常见的糖)中酵母菌并不能直接获取葡萄糖。

不同酵母菌对不同碳源的吸收利用程度不同,见表2。对酿酒酵母来说,葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖和麦芽糖被认为是良好的生长和发酵底物,其他碳源(如乙醇和醋酸盐)只能在酿酒酵母中作为呼吸底物存在。

表2 酵母生长所需的各种碳源

酵母菌是化能异养型微生物,但也有一小部分酵母菌(约占总酵母种类的5%)可通过同化二氧化碳获得所需碳源。在氨基酸生物合成的三羧酸循环中取代二羧酸的反应中,以及脂肪酸、嘌呤和嘧啶的生物合成中,二氧化碳的固定是必要的。因此,二氧化碳也应该被认为是酵母营养的碳“基质”。

1.2 氢

酵母细胞的氢元素主要来自于碳水化合物。酵母在酸性环境(pH值为4~6)中生长良好,而在碱性环境中难以生长。与绝大多数细菌相比,酵母耐受的pH值更低。这种特性帮助酵母占据不同的生态位以及存在于腐败的酸性食物中。氢离子(质子)对于酵母细胞的生理功能至关重要,细胞外和细胞内pH值的变化显著影响酵母细胞的生长和代谢。例如,酵母细胞利用葡萄糖生长的最佳pH值是6.5,而发酵的最佳pH值是5.0[5]。当初始培养基的pH值在4~6,酵母细胞通常生长的非常好,但许多酵母能够在相当宽的pH值范围内(2~8)生长。通常酵母细胞不能很好地在碱性条件下生长,但某些海洋酵母特别适合在弱碱性海水中生长。活跃生长的酵母细胞通过离子吸收、营养物质运输过程中离子分泌、有机酸分泌和CO2的释放等方式组合来使培养基酸化。乙醇的发酵对中等pH值的变化特别敏感。通过质膜质子泵ATPase的作用将细胞内pH值调节在相对狭窄的范围内,对酵母细胞营养物质吸收和代谢起着重要作用。除培养基包含乙酸盐或山梨酸盐等有机酸外,细胞外pH值变化对酵母胞质pH值的影响有限。

1.3 氧

尽管酵母能够在厌氧条件下发酵,但在完全没有氧气的环境中酵母不能很好地生长。氧气不仅能为呼吸相关的酶提供底物,还是甾醇和不饱和脂肪酸生物合成过程中羟基化所必须的。具体来说,酵母细胞需要分子氧用于多功能氧化酶介导的三十碳六烯-2,3-环氧化物形成羊毛甾醇,以及用于合成不饱和脂肪酰基辅酶-A酯。在无氧条件下,酿酒酵母生长需要麦角甾醇和油酸,消除了其可以真正厌氧生长的观念。因此,氧含量被认为是酵母细胞生长的重要影响因素。

不同酵母对分子氧的需求不同,纯氧对酵母细胞的生长具有强烈的抑制作用。高压氧对酵母细胞的毒性与细胞周期有关。

酵母工业中对于细胞呼吸生长的优化至关重要,生物反应器中需要维持足够的氧浓度,从而支持酵母的快速生长。

在特定的酵母生物技术领域中,呼吸作用促进细胞生长至关重要(例如面包酵母和酵母生物质蛋白产业),为保证酵母细胞的快速生长必须在生物反应器中给予足够的氧气。氧气微溶于水,酵母繁殖过程中发展出各种提高氧气吸收率的生物工程方法,氧气的传递速率表示为KLac(KL是大气O2通过液体界面进入溶液的速率,a是界面的面积,c是介质中的氧浓度)。在实验室中,用于摇瓶培养的锯齿状凹痕,能显著增加KLac值,改善氧转移,从而促进酵母的生长。此外,在酿造发酵中,常认为是纯厌氧发酵,初始氧气和种子液有氧生长与随后的发酵极其重要。

1.4 氮

酵母中氮元素约占细胞干重的10%。酵母不能固定分子氮,其广泛使用的氮源包括无机氮源和有机氮源。酵母培养基中最常使用的氮源是硫酸铵;有些酵母可以利用硝酸盐和亚硝酸盐作为氮源。硝酸盐同化能力长期以来被用作某些酵母属的生理鉴别依据。例如,Hansenulaspp.是硝酸盐阳性的,Pichiaspp.归类为硝酸盐阴性。类似地,对于尿素,大多数担子菌酵母是脲酶阳性的,而大多数子囊酵母是脲酶阴性的。

常见的有机氮源包括氨基酸、肽类、嘌呤、嘧啶和胺等,其中谷氨酸和天冬氨酸可以作为良好的氮源。

在工业发酵培养基中,麦芽汁与氨基酸混合物被酵母细胞的吸收顺序见表3。对于某些实验室酵母培养基,氨基酸混合物也可促进生长,也可以以蛋白质水解物的形式提供氮源。但是单独添加胱氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸或苏氨酸不能使酿酒酵母很好地生长。有些酵母菌虽然不是常规的Saccharomycesspp.,但能够利用细胞外蛋白酶分泌后产生的氨基酸和低分子质量肽。

表3 啤酒酵母对氨基酸的吸收顺序

1.5 硫

酵母对硫元素的需求主要是合成含硫的氨基酸,硫含量约占细胞干重的0.3%。很多含硫化合物都能为酵母提供硫元素,如硫酸盐、亚硫酸盐、硫代硫酸盐、甲硫氨酸和谷胱甘肽等。无机硫和甲硫氨酸是酵母硫代谢中最重要的两种化合物,其中甲硫氨酸在酵母营养中是使用效率最高的氨基酸[6]。

1.6 磷

磷存在于核酸和磷脂中,对所有酵母菌都是必需的。酵母细胞质负电荷是由于有机化合物中存在无机磷酸盐和磷酸盐基团。酵母细胞的磷酸盐含量约占细胞干重的3%~5%,主要是以正磷酸盐(H2PO4-)的形式存在。正磷酸盐和浓缩无机磷酸盐是酵母生长培养基中常见的磷源。正磷酸盐是许多酶的底物和效应体,包括那些参与能量转导的酶。胞质磷酸盐在酵母细胞中含量很低,约为细胞干重的0.2%。然而,这取决于酵母细胞所采用的糖分解代谢模式。例如,当细胞表现出短期的Crabtree效应时,在葡萄糖脉冲期间,细胞内磷酸盐显著上升。酵母还可以有效地将磷酸盐储存在细胞器中,L.A.Okorokov[7]等研究表明,液泡中的磷酸盐浓度比细胞质高110倍。

1.7 常量金属元素(K、Na、Ca、Mg)

酵母对无机元素的需求与其他微生物类似,包括大量元素和微量元素。大量元素所需浓度为毫摩尔范围,如K和Mg。

酵母的生长对钾有绝对需求,钾是各种酶的辅助因子,这些酶参与氧化磷酸化、蛋白质生物合成和碳水化合物代谢。钾也参与到磷酸盐等其他营养素的吸收,可以作为非特异性电荷平衡剂以及大分子和核糖体的稳定剂。酵母细胞中的钾含量随生长条件变化而变化,通常占细胞干重的1%~2%。H.Aiking等[8]限制钾浓度培养产朊假丝酵母,试验证明细胞内钾的含量随酵母生长速率的线性变化而变化。就控制生长速率和利用率而言,K+的类似物Rb+是唯一可以替代K+的碱性金属阳离子。J.Perkins等[9]研究发现,在深红酵母菌(Rhodotorula rubra)的丙酮酸激酶活化中,除了Rb+外,NH4+离子也可以部分替代K+。

虽然部分酵母菌在氯化钠溶液中能较好地生长,但没有证据表明酵母细胞在低盐浓度下需要钠离子。耐盐酵母,如Debaryomyces hanseni,Pichia miso和Zygosaccharomyces rouxii,已经适应了特殊的渗透调节机制,可以在高浓度NaCl溶液中生长。酵母对渗透压胁迫和离子胁迫的生理反应将在后文中进一步讨论。

镁是酵母生长的绝对必需元素,占细胞干重的0.3%,在细胞结构和代谢功能方面起着重要的作用。例如,转磷酸酶依赖于Mg2+离子,涉及遗传信息的合成、表达和翻译的酶也依赖于Mg2+离子。酵母细胞Mg2+含量随生长条件和细胞周期变化。没有其他阳离子可以替代Mg2+对酵母细胞生理进行影响,尽管在Mg2+限制生长的情况下,酵母细胞可以合成亚精胺和腐胺等阳离子多胺。

酵母细胞生长所需钙离子含量存在分歧。据报道钙浓度可低至10-9mol·L-1。由于必需的Mg2+依赖性功能的拮抗作用,高水平的Ca2+可能会抑制酵母的生长。

R.P.Jones等[10-11]综述了矿物质离子对酵母细胞发酵的作用和影响。利用元素质量平衡和程序搜索技术计算了几种促进酵母生长的阳离子和阴离子的最佳水平。然而,由于菌株差异、培养基螯合和离子相互作用等因素,很难对离子需求进行精准定量。关于后者,G.Chandrasena等[12]已经开发了一种模型,以确定阳离子相互作用,用于预测酵母发酵性能。

2 酵母的培养与培养基

酵母对营养的需求相对简单,因此培养酵母较为容易[3-4]。实验室中广泛用于酵母培养的天然培养基有两种:一种是麦芽提取物肉汤(MEB);另一种是由酵母提取物、蛋白胨和葡萄糖组成的培养基,用于实验室菌株日常维护。Schwanniomyces occidentalis、Kluyveromyces lactis、Pichia pastoris、Hansenula polymorpha、Yarrowia lipolytica、Candida maltosa和Trichosporon cutaneum等 酵 母 均有专门的培养基配方,用于培养、产孢。实验室中常用的其他复杂酵母培养基包括:医学上重要酵母菌培养所用的Sabouraud培养基(葡萄糖加真菌性蛋白胨),酿酒酵母培养所用的合成培养基Yeast nitrogen bases可用于碳同化和发酵测试。也可以使用Yeast carbon base,它需要补充氮源。其他合成培养基也被开发用于实验室培养酵母,例如Edinburgh minimal medium培养基被开发用于Schizoscharomyces pombe的生长。为了使合成培养基更加丰富,可以添加酵母提取物,就变成了“半合成培养基”。

在发酵工业中,通常利用糖蜜和麦芽汁等价格低廉的副产品来培养酵母[13],但需要注意以下几点:一是酵母繁殖培养基可能不适用于酵母发酵,低浓度糖蜜阻止葡萄糖抑制效应,从而促进酵母呼吸,而高浓度糖蜜有利于酵母发酵;二是在培养基中适当加入一些营养物质混合物,有利于酵母发酵;三是有些工业发酵培养基中可能含有少量抑制酵母生长的有毒物质,如糖蜜连续加热后会发生焦糖化反应,从而产生焦糖和糖醛类物质。

酵母的选择培养基中通常添加某些抗细菌剂、抗真菌剂和抗酵母剂,通过选择性抑制其他微生物的生长将酵母分离出来。鉴于酵母生长的pH值较低,也可以使用酸性琼脂培养基(pH值为3.7)从土壤中分离酵母,此时绝大多数细菌的生长受到抑制。在酿造酵母的存在下,结晶紫加上品红-亚硫酸盐可以选择性地用于测定野生型酵母。环己酰亚胺对某些酵母菌有选择性抑制作用,可用于检测酿造样品野生酵母菌的存在。也可以使用特定培养基来选择具有特定营养要求的酵母。例如,食品样品中的鲁氏酵母可用高渗透压的培养基,啤酒样品中的非野生酵母可用赖氨酸(作为唯一的N来源)琼脂培养基。

在工业应用中酵母培养基的使用应注意以下几点。首先,酵母繁殖培养基不一定适用于发酵。例如,糖蜜用于酵母细胞积累生物量和生产乙醇。酵母细胞积累生物量,必须通过控制营养摄入使糖同化保持在较低水平,以防止葡萄糖抑制和促进呼吸代谢。酵母细胞生产乙醇,由于需要发酵代谢,糖水平可以保持很高。使用糖蜜,还需要解决其他关键营养物质的供应问题。例如,糖蜜中可利用的氮和磷酸盐的含量低,需要适当地补充以保证酵母的正常生长。Mg2+等必需阳离子的浓度也需要加以注意。

一些酵母发酵得益于添加培养基补充剂或酵母提取物。例如,麦芽汁通常被认为是一种完全发酵培养基,但也有人提倡在麦芽汁中添加混合营养物质以平衡酵母发酵期间的营养供应。少量补充氨基酸、小肽、脂类、矿物质和维生素的混合物,可以保证酵母活性的一致性,从而最大程度地减少产品风味变化。

一些工业发酵培养基中可能含有少量的对酵母有毒或抑制生长的化合物。某些化合物可能是在培养基灭菌或巴氏灭菌的热处理过程中产生的。例如,糖蜜过度加热与氨基氮化合物之间的美拉德反应,产生不需要的焦糖化产物。热还可能破坏维生素和酵母生长必不可少的其他生长因子。

当使用恒化器对酵母进行连续培养时,需要将营养物质持续不断地加入到培养容器中,同时以同样的流速不断流出培养物,从而将培养容器中的培养物维持在恒定的体积。此时的培养液中某一种营养物质为生长限制因子,通过控制其浓度,使得酵母以一定的生长速率生长。恒化器可以用来测定酵母的比生长速率,对于理解酵母营养和代谢等诸多方面具有重要意义。

生化培养箱对细胞生理学家了解酵母营养的不同需求非常有用。例如,优化培养基成分、研究糖的运输和代谢、确定不同酵母物种对同一糖的竞争或混合糖中对单一物种的竞争。

酵母菌同邻近微生物的竞争优势与营养物质的吸收率有关。酵母需要以特定的速率将有机和无机溶质转移到细胞内,该速率将影响细胞生长的速率。酵母细胞膜控制营养物质的运输速率,可以用营养物转运亲和常数和溶质转运通量(单位时间内膜单位表面积运输的摩尔数)来描述。因此,计算不同溶质和不同酵母的米氏常数值有助于了解营养物的转运亲和力,当米氏常数值较低时表示较高的转运亲和力,而米氏常数值较高时表示较低的转运亲和力。例如,同一糖和同一酵母培养获得两个溶质转运通值量(Kt值),表示糖被两个过程吸收,并且生物体对糖的利用表现出双相动力学。了解米氏常数值有助于理解酵母发酵过程中的糖摄取,特别是当存在混合底物或混合培养物时。例如,产朊假丝酵母(Candida utilis)对葡萄糖具有非常高的亲和力,在食品工业酿酒酵母发酵过程中是潜在的污染物。这是因为酿酒酵母对葡萄糖具有较低的亲和力,葡萄糖进入细胞膜采用单纯扩散吸收而不是主动转运吸收。

当细胞遭遇饥饿时,酵母菌会启动营养物质获得的其他生理反应。当缺乏必要的营养物质,如碳、氮或磷源时,酵母细胞的分裂周期通常阻止G1期开始而停留在G0期。有性繁殖的酵母菌,消耗碳或氮源可能形成孢子。在酿酒酵母中,孢子形成过程使葡萄糖转运系统失活。U.Schulze等[14]对酿酒酵母中氮饥饿的生理效应进行了详细的研究。当细胞缺乏铵离子时,胞内的RNA、蛋白质、海藻糖和糖原以及酵母的生长能都发生了巨大变化。

(下期待续)

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