刘 双,王亚男

湖南省妇幼保健院妇产科,湖南长沙 410008

宫颈癌是危害女性健康的主要生殖系统恶性肿瘤之一，其病死率可达50%[1]，因此对宫颈癌进行早发现早干预具有重要的临床实践意义。高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)感染是宫颈癌发生、发展的危险因素，但是从HR-HPV感染到成为宫颈癌是一个多基因、多因素共同作用的过程[2]。而目前，宫颈癌的早期筛查方法及标志物比较缺乏，因此寻找一种特异性的分子标志物对宫颈癌及其癌前病变进行早期识别具有重要意义。FAM19A4是TAFA基因家族成员，已经有研究证实，FAM19A4甲基化与宫颈癌及其癌前病变存在密切关系，有望成为一种新型的宫颈癌早期筛查标志物[3]。但是目前，关于FAM19A4甲基化与不同基因型人乳头瘤病毒(HPV)感染宫颈癌相关性方面的研究报道比较少见。基于此，本研究将通过探讨FAM19A4甲基化检测在HR-HPV阳性宫颈癌及其癌前病变评估中的临床价值，以期为宫颈癌的早期防控提供参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 连续性纳入2020年1-12月本院收治的80例宫颈癌患者作为宫颈癌组，年龄30～70岁，平均(47.55±8.43)岁；以90例宫颈癌前病变患者作为癌前病变组，年龄28～70岁，平均(45.20±6.91)岁；以同期的80例健康体检者作为对照组，年龄20～60岁，平均(42.19±5.57)岁。3组研究对象的年龄比较差异无统计学意义(P<0.05)。病例入选标准：(1)所有患者均在阴道镜下经宫颈组织病理学确诊分组，且经两位高级职称病理科医生核实，宫颈癌按2018年FIGO指南分期[4]；(2)癌前病变符合《2019 ASCCP宫颈癌筛查和癌前病变管理指南共识》[5]中的相关诊断标准；(3)纳入研究前未进行相关药物治疗及手术；(4)患者年龄≥18岁。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤;(2)伴有其他宫颈疾病或并发症；(3)先天性子宫发育不良；(4)临床、影像及病理资料不完整；(5)诊疗依从性比较差。本研究经过医院医学伦理委员会的审批，患者或家属均知情并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1HPV的筛查及基因分型 采集宫颈脱落细胞保存于采集瓶中，保存条件4 ℃。标本采集前72 h禁止性行为、阴道用药及冲洗。采用杂交捕获法进行HPV的筛查及基因分型，该方法能够检出13种HR-HPV。

1.2.2DNA提取 利用TIANamp GenomicDNA提取试剂盒提取HR-HPV阳性者的宫颈脱落细胞标本中的DNA，按试剂盒说明书操作。立即使用紫外分光光度计对以上提取的DNA进行浓度测量。

1.2.3重亚硫酸盐修饰 取HR-HPV阳性者的宫颈脱落细胞标本进行DNA的提取，然后按照试剂盒说明书要求进行重亚硫酸盐修饰(EZ DNA甲基化试剂盒-DIRECT由Zymo Research公司提供)；加入900 μL ddH2O和300 μL M-Dilution Buffer和50 μL M-Dissolving S Buffer到CT Conversion Reagent干粉中，充分混匀，室温下漩涡振荡10 min；将DNA 标本加入PCR管中，130 μL CT Conversion Reagent，充分混匀。反转录反应条件如下：98 ℃，10 min；64 ℃，30 min；4 ℃保存最长20 h；上述制备的重亚硫酸盐修饰后 DNA 使用 Quawell Q5000 紫外分光光度计进行浓度测量，立即用于PCR检测。

1.2.4荧光定量PCR 以ACTB作为内参基因进行PCR扩增，扩增引物见表1。扩增条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性15 s，56 ℃退火20 s及65 ℃延伸40 s，共40个循环。每个标本均重复试验3次。扩增结果通过采集荧光信号，得到循环阈值(Ct值)及ACTB和FAM19A4的扩增曲线。所有样品的CtACTB值均< 32，以保证样品质量，CtFAM19A4值>40的标本被认为代表阴性检测结果，CtFAM19A4值<40的标本计算甲基化评分，计算公式：2(CtACTB -CtFAM19A4)×100。扩增曲线目标基因越早扩增，甲基化评分越高，表示基因甲基化水平越高。

表1 扩增引物序列

2 结 果

2.13组HR-HPV检出率的比较 宫颈癌组、癌前病变组及对照组的HR-HPV阳性率分别为92.50%(74/80)、55.56%(50/90)及7.50%(6/80)，差异有统计学意义(P<0.05)。3组HR-HPV阳性者中HPV16/18的感染率分别为66.22%(49/74)、56.00%(28/50)及16.67%(1/6)。

2.23组HR-HPV阳性者FAM19A4基因甲基化检出率的比较 宫颈癌组FAM19A4基因甲基化检出率最高,对照组检出率最低，组间差异具有统计学意义(P<0.05)。采用 Cochran-Armitage趋势检验发现宫颈病变程度与FAM19A4甲基化之间存在线性趋势(P<0.05)，即随着宫颈病变严重程度增加，FAM19A4基因甲基化的检出率逐渐升高。见表2。

表2 3组HR-HPV阳性者FAM19A4基因甲基化检出率的比较

2.3HR-HPV感染的类型与FAM19A4基因甲基化检出率的关系 HR-HPV阳性者的宫颈脱落细胞中，宫颈癌组HPV16/18阳性者的FAM19A4基因甲基化检出率(100.00%)高于非HPV16/18阳性者(92.00%)，差异有统计学意义(P<0.05)；癌前病变组中HPV16/18阳性者的FAM19A4甲基化检出率(75.00%)高于非HPV16/18阳性者(68.18%)，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 HR-HPV感染的类型与FAM19A4基因甲基化检出率的关系

3 讨 论

宫颈癌对女性的生命健康产生严重影响。HPV基因分型和液基薄层细胞学检查(TCT)是目前临床对宫颈癌进行筛查的主要手段，但是TCT的灵敏度比较低，容易产生假阴性，HPV基因分型与TCT联合检测的灵敏度虽然得到了提高，但是特异性并没有得到改善[6]。有研究证实，降低或者清除HPV感染能够对宫颈癌起到有效的防治作用，但是目前还没有治疗HPV感染的特效方法[7]。本研究对宫颈癌患者、宫颈癌前病变患者及健康体检者中的HR-HPV阳性率进行了筛查，结果显示：宫颈癌患者的HR-HPV阳性率(92.50%)最高，其次是宫颈癌前病变患者(55.56%)、健康体检者(7.50%)，具有明显差异，与以往研究的报道一致[8]。说明HR-HPV感染对宫颈癌及其癌前病变的早期筛查具有重要意义。

单纯的HR-HPV感染并不足以导致宫颈上皮细胞发生恶变，表观遗传学发生改变能够对宫颈癌的发生、发展产生影响[9]。FAM19A4是一种分泌蛋白，在正常组织中呈低水平表达，在单核细胞及巨噬细胞中呈高水平表达，能够对巨噬细胞的吞噬及迁移起到促进作用，对炎症及应激反应起到调控作用[10]。有研究显示，宫颈癌组织中FAM19A4甲基化的检出率明显高于正常组织[11]。多项研究证实，FAM19A4甲基化在宫颈癌的发生、发展中具有重要作用[12-13]。本研究通过检测HR-HPV阳性患者宫颈脱落细胞标本中的 FAM19A4甲基化，结果显示随着宫颈病变严重程度增加，FAM19A4甲基化检出率升高。本研究还发现HR-HPV阳性宫颈癌患者中HPV16/18阳性者的FAM19A4基因甲基化检出率高于非HPV16/18阳性者(P<0.05)，在癌前病变组该差异无统计学意义可能与样本量小有关。目前，关于HPV感染与宫颈癌基因异常甲基化之间的相关性还不够清楚；有研究显示，HR-HPV的E6/E7基因能够促进DNA甲基转移酶1的表达，对E6基因进行敲除后DNA甲基转移酶1的表达也降低[14-15]；在转染了HPV16/18的细胞中，DNA甲基转移酶1与DNA甲基转移酶3b均呈高水平的表达[16]。由此，本研究可以认为宫颈癌及其癌前病变组织中FAM19A4甲基化的改变，可能与 HPV16/18诱导的表观遗传重新编程有关。

综上所述，FAM19A4 基因可能是宫颈细胞癌变的特异性分子标志物，该基因甲基化可能在宫颈癌的发生、发展中起着一定作用。宫颈脱落细胞FAM19A4基因甲基化检测可能作为宫颈癌及癌前病变的辅助筛查方法。然而，为了进一步确认其诊断价值，需要进行大样本量的前瞻性研究。