李春野， 李 惠

哈尔滨医科大学附属第二医院消化内科，黑龙江 哈尔滨 150000

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是在未过量饮酒和其他导致肝脏脂肪变性的情况下，以肝细胞脂质过度堆积为主要特征的临床病理综合征[1]。NAFLD包括非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFL)也称单纯性脂肪性肝病，以及由其演变的非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)，后者可进展为病变程度更严重的脂肪性肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)[2]。越来越多的证据表明，表观遗传机制影响NAFLD的发生与发展。DNA甲基化是导致NAFLD基因表达异常的主要表观遗传学改变之一[3]，被认为是肝脏表型从正常肝组织学到单纯性肝脂肪变性再到炎症和纤维化过程中的一个“分子钟”[4]。一些研究也建议将DNA甲基化状态作为NAFLD进展的标志[5]。因此，本文对目前DNA甲基化在NAFLD中的研究进展、影响因素及潜在临床意义进行分析，以期加深对DNA甲基化和NAFLD关系的认识，并对以之为潜在治疗靶点的临床意义进行进一步挖掘与探索，改善患者的生存及预后。

1 NAFLD的流行病学分析、危险因素及发病机制研究进展

NAFLD的患病率为15%～70%，因种族和诊断方法的不同而不同。全球NAFLD患病人数高达10亿[6]，已成为目前公认的全球最常见的慢性肝病[7]。据估计，NASH影响了全球3%～5%的人口[8]，NAFLD是美国慢性肝病最普遍的原因，影响8 000万至1亿人，其中NASH几乎占25%[6]。我国NAFLD患病率为29.2%，中年、男性、西北地区和台湾地区、人均国内生产总值(GDP)>10万元的地区、维吾尔族和回族人群的疾病负担较重。我国受NAFLD影响的人口在10年内从18%急剧增加到29%，患病率以西方国家的两倍多的速度增长。据预测，到2030年，我国将成为全球NAFLD患病率增长最快的国家，将有3.1458亿例。此外，我国NAFLD的中位年龄是世界上最年轻的，这意味着其晚期并发症的最大影响将发生在以后的几十年[9]。

NAFLD的发病及进展是一个复杂的过程，其机制尚不清楚[10]。环境因素(饮食、生活方式、肠道微生物区系等)与遗传和表观遗传背景协同作用，促进肝脏胰岛素抵抗、慢性肝炎和坏死性炎症。代谢失衡、内质网(ER)和氧化应激、脂毒性(由非酯化胆固醇、神经酰胺或二酰甘油引起)和病原体相关分子模式(PAMPs)的存在(由增加的肠道生物失调和肠道通透性促进)导致肝细胞损伤和死亡、免疫细胞浸润、纤维化和疾病进展[10]。

NAFLD与肥胖、胰岛素抵抗、高血压、血脂异常、2型糖尿病(T2DM)、代谢综合征及心血管疾病密切相关[11-13]。包括澳大利亚、美国、新西兰、英国等范围内NAFLD发病率的上升在一定程度上是由肥胖率和T2DM的激增推动的[14]。Meta回归模型显示，地理区域和平均年龄与NAFLD的患病率有关(P<0.05)[7]。Ekstedt等[15]进行长达33年的随访研究表明，NAFLD患者的死亡风险增加，且NAFLD患者的纤维化阶段可以预测总体死亡率和疾病特异性死亡率。

2 DNA甲基化与NAFLD

2.1 DNA甲基化越来越多的证据表明，表观遗传机制影响NAFLD的发生与发展。DNA甲基化是一种基本的表观遗传修饰，也是研究最广泛和表征最好的表观遗传标记[16]，在基因组印迹、细胞分化、胚胎发育、X染色体失活和染色体稳定等诸多过程中发挥着重要作用[17]。

DNA甲基化是指胞嘧啶的第5位碳原子在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的作用下被甲基化修饰为5-甲基胞嘧啶(5mC)[18-19]。在人类和其他哺乳动物中，这种修饰只强加于DNA序列中鸟苷之前的胞嘧啶(CpG二核苷酸)。发生DNA甲基化的CpG二核苷酸在基因组中的分布不均，这些二核苷酸可以聚集在称为“CpG岛”的DNA的小片段(0.5～4.0 kb)中，这些区域通常与DNA转录成RNA的开始部位-启动子区域[包括转录起始位点(TSS)1500、TSS200、5′非翻译区(UTR)和第一外显子]有关。在基因组的大部分中，约80%与CpG岛无关的CpG二核苷酸是高度甲基化的。相反，CpG岛上的二核苷酸，特别是那些与基因启动子相关的二核苷酸，无论基因是否正在转录，通常是未甲基化的[20]。约60%的人类基因在其启动子上有CpG岛[21]，基因启动子区域的甲基化通常与基因沉默相关[20]。

2.2 NAFLD患者基因多位点发生DNA甲基化改变

NAFLD患者中，DNA发生甲基化并引起沉默效应相对比较普遍。很多研究均证明，NAFLD患者DNA多位点发生甲基化改变，与疾病的发生及进展密切相关，也有许多基因是组织特异性甲基化，因此在疾病过程中不发生变化。NAFLD患者的肝细胞和白细胞具有相同的DNA甲基化模式，即全局低甲基化模式[22]。Murphy等[23]在NAFLD组织中观察到TSS和大多数CGI的整体低甲基化。常染色体和性染色体的甲基化也不同，X染色体上CGI的相对高甲基化，这可能是由于女性的X染色体失活导致。在比较轻度和晚期NAFLD的甲基化情况时，在CGI海岸(距CGI 0～2 kb)观察到轻度和重度NAFLD之间的差异甲基化显著增加。许多组织修复基因在晚期NAFLD中低甲基化和高表达(如COL1A1、LAMA4、CCR7等)，而某些代谢基因高甲基化和表达下调(如APOC4、CYP2C19、SLCO1B3等)。Zhang等[22]在外周血细胞中发现863个差异甲基化(DM)CpG位点，详细地说，编码区的高甲基化和低甲基化位点的比例远远高于基因组的其他区域。在基因组的非编码区，启动子和基因间隔区的CGI分别含有丰富的低甲基化和高甲基化位点。这些发现表明，DM基因座虽然数量有限，但在基因组的生物区高度富集。且研究发现调控糖脂代谢、脂肪性肝炎、纤维化和癌变基因的CpG位点甲基化改变与NAFLD密切相关；Wu等[4]研究分析NAFLD患者的循环血白细胞含有65个CpG位点，与健康对照组相比，这与60个差异甲基化的基因密切相关，在NAFLD患者和正常对照组中被发现显著甲基化，且半数以上与NAFLD相关的CpG位点主要表现为低甲基化。

2.3 DNA甲基化参与NAFLD的发病过程在NAFLD的发病中，DNA甲基化也起到不可或缺的作用。Walle等[24]研究表明，肝脏脂肪酸去饱和酶(fatty acid desaturase，FADS)2基因变异可能通过改变DNA甲基化，参与NAFLD的发病。酰辅酶A合成酶长链家族成员4(long chain acyl-CoA synthetase 4，ACSL4)(Cg15536552)和肉碱棕榈酰转移酶1C(carnitine palmitoyltransferase 1C，CPT1C)(Cg21604803)低甲基化位点与NAFLD发病风险相关。ACSL4(Cg15536552)甲基化水平降低增加了NASH的易感性[22]。

2.4 DNA甲基化在NAFLD疾病进展中的作用多种基因参与脂质代谢过程，而部分基因发生甲基化即可导致肝脏脂质代谢异常。Borowa-Mazgaj等[25]研究发现，NAFLD的发生和发展与由甘氨酸N-甲基转移酶(glycine N-methyltransferase，GNMT)启动子胞嘧啶DNA高甲基化介导的GNMT下调密切相关。干扰素调节因子6(interferon regulatory factor 6，IRF6)基因启动子高甲基化下调，不能抑制过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)γ及其靶点，从而导致脂质代谢异常[26]。ACSL4在高脂血症小鼠血浆甘油三酯和葡萄糖代谢及肝脏磷脂合成中起关键作用[27]。锌指蛋白300(ZNF300)通过PPARα促进脂肪酸氧化而在肝脏脂质代谢中发挥重要作用，这种作用可能被DNMT3a介导的ZNF300甲基化所阻断[28]。

2.5 DNA甲基化与NAFLD严重程度相关越来越多的研究表明，NAFLD的严重程度与DNA甲基化水平有关(见表1)，且不同位点的甲基化程度可能与NAFLD严重程度呈正或负相关。位于PARVB变异体1调节区的CpG26在晚期NAFLD患者的肝脏中显著低甲基化。相反，在这些患者中，PNPLA3调节区的CpG99高度甲基化[29]，而与轻度NAFLD患者相比，晚期NAFLD患者PPARα启动子目标区的CpG3具有显著更高的DNA甲基化。类似地，PPARδ启动子靶区内的CpG2的DNA甲基化程度在重度组显著增加[17]。Hardy等[30]发现，与轻度NAFLD患者相比，重度NAFLD患者PPARγ基因启动子上CpG1和CpG2的甲基化程度更高，PPARγ基因启动子上CpG1甲基化阈值81%是区分轻度和晚期纤维化的最佳分界值。Wu等[4]研究证明，与正常肝脏和单纯性肝脏脂肪变性相比，NASH与不同的DNA甲基化有关，其中SSBP1和SIGIRR对NASH和单纯性肝脂肪变性有较好的鉴别作用。

表1 预测NAFLD严重程度的DNA甲基化相关的基因列表

另一方面，也有研究表明，随着肝脏炎症程度的加重和疾病的进展，NAFLD患者整体DNA甲基化水平呈下降趋势[31]。晚期NAFLD患者的肝脏PNPLA3 mRNA水平低于轻度NAFLD患者，且与肝DNA中CpG99甲基化水平呈负相关[29]。重度NAFLD组血小板衍生生长因子α(platelet-derived growth factor alpha，PDGFα)启动子CpG3甲基化程度仅为轻度肝病组的一半[17]。Tu等[32]研究表明，脂肪心磷脂合酶1(adipose cardiolipin synthase 1，CRLS1)通过抑制激活转录因子3(activating transcription factor 3，ATF3)的表达和活性，减轻NASH病理过程中的胰岛素抵抗、肝脏脂肪变性、炎症和纤维化。

2.6 DNA甲基化与NAFLD癌变除了参与NAFLD发生、发展及在决定疾病严重程度过程中起到一定作用之外，一些研究表明DNA甲基化也参与NAFLD恶变。Hotta等[33]利用共甲基化和差异甲基化区域(DMR)分析证明，晚期NAFLD患者肝脏线粒体功能、氧化还原酶活性和代谢的降低发生在DNA甲基化水平，并在DNA甲基化水平获得致瘤潜能。Kuramoto等[34]在肿瘤相关基因中发现了NASH和NASH相关的HCC特异性DNA甲基化改变，这种改变与mRNA表达异常相关，可能参与NASH相关的多阶段肝癌的发生。Sung等[35]报道，ACSL4的高表达与HCC的分级和分期密切相关，是HCC中总生存期(OS)独立的预后危险因素，与索拉非尼治疗晚期HCC患者的良好预后相关，可用于预测索拉非尼在HCC中的敏感性[36]。

Wu等[4]研究发现，在与NAFLD相关的CpG位点，包括钾电压门控通道亚家族Q成员3(potassium voltage-gated channel subfamily Q member 3，KCNQ3)、岩藻糖基转移酶(fucosyltransferases，FUT)11、双特异性磷酸酶16(dual-specificity phosphatase 16，DUSP16)、钙调蛋白结合转录激活因子1(calmodulin binding transcription activator 1，CAMTA1)、G2和S期表达1(G2and S-phase expressed 1，GTSE1)，似乎与NAFLD有密切的联系，并且发生HCC的风险更高，其中GTSE1的高表达与HCC患者的病理分期和预后不良有关[37]，可能是预测肝癌预后的分子标志物[38]。

3 NAFLD患者发生DNA甲基化的影响因素

对DNA甲基化研究的发展揭示了DNA甲基化不是固定的，而是高度动态的，并且对细胞和组织微环境作出反应[17]。环境因素会影响DNA甲基化，下面列举出一些对DNA甲基化的主要影响因素。

饮食是影响DNA甲基化的主要因素之一。研究发现，高脂饲料和高脂饲料加果糖喂养的小鼠降低了脂肪酸氧化的限速酶CTP1A的活性[39-40]，可能通过DNA CpG甲基化从而特异性激活DNMT1，调节细胞内脂质代谢相关基因的表达[41]。研究发现一碳供体(包括甜菜碱、胆碱、叶酸)均有剂量依赖性的改善NAFLD的效果，它们还能改善血清和肝脏氧化还原系统、肝脏S-腺苷蛋氨酸/S-腺苷同型半胱氨酸(SAM/SAH)比值，并增加肝脏整体DNA甲基化[42]。

子宫内代谢环境对DNA甲基化的影响是其增加NAFLD易感性的机制之一。动物模型研究表明，子宫内过多的胆固醇暴露可以使子代易患上NAFLD，这种早期发育可以持续整个生命周期[43]。

中医药对DNA甲基化的影响是其发挥作用的机制之一。含砷中草药方剂(CHF)青黄可引起全基因组显著去甲基化，并影响染色体核型状态和基因组甲基化水平[44]。白藜芦醇可降低NAFLD条件下DNA甲基转移酶的表达和活性，减轻氧化应激和脂质堆积[45]，而且适当摄取白藜芦醇可能是预防NASH发生发展的潜在途径[46]。

减肥手术是影响DNA甲基化的因素之一。在减肥手术前后编码蛋白酪氨酸磷酸酶ε(PTPRE)的基因表现出差异表达和差异甲基化，失去甲基化的CpG位点通常在从正常肝脏向NASH进展的过程中获得甲基化[47]。Benton等[48]分析了肥胖女性在胃旁路手术和显著减肥前后脂肪组织中的DNA甲基化，共分析了485 577个CpG位点。配对分析显示大网膜和皮下脂肪组织的甲基化显著不同。在体质量下降之前，CpGs有较大比例的高甲基化，并且在3’UTR和基因体中观察到相对于启动子区域的甲基化增加[48]。

体育锻炼也是影响DNA甲基化的因素之一，同时也是一种有益的非药物预防和治疗策略。研究发现，运动训练能够改变小鼠肌肉生长和分化相关基因的DNA甲基化模式[49]，而且运动能够诱导PGC-1α、PDK4和PPAR-δ的表达呈剂量依赖性，启动子的甲基化水平显著降低[50]。体育锻炼已被证明对代谢性肝功能障碍的某些病理特征有益处，尤其是线粒体功能障碍[5]。

4 DNA甲基化对于NAFLD治疗的潜在临床意义

NAFLD的最佳非侵入性检测方法仍在开发中，我们期待未来可以开发出一种检查方法可以接近甚至超过肝活检的临床价值。Wu等[4]结果表明，DNA甲基化的表观遗传学变化可能与临床参数相关，包括血清肝酶、血脂谱及NAFLD的组织学特征。且研究发现，NAFLD患者外周血白细胞中存在甲基化CpG位点的改变，这些血源性生物标志物可能对NASH的临床研究和诊断有潜在价值。5hmC谱是NAFLD中基因转录的有用标志和细胞状态的标志，并提示5hmC谱有可能作为与肥胖相关的异常肝生理的生物标志物[51]。

Zeybel等[17]研究发现，肝脏中每个CpG位点的甲基化在个体内的变异相当低，甲基化水平似乎不受年龄或性别的影响，这表明单个位点肝活检可能足以提供代表整个器官的DNA甲基化的定量估计。Murphy等[52]对特征良好的轻度或晚期NAFLD患者肝脏进行全基因组甲基化和肝脏基因表达(GEX)数据综合分析，结果表明在晚期NAFLD中发生的甲基组-转录组相互作用可以调节NAFLD的结果，包括癌症和/或肝硬化的发展。

NASH是HCC发生的独立危险因素[53]。DNA甲基化模式的改变可能是与肿瘤发生相关的最早可检测到的肿瘤变化之一。携带循环肿瘤DNA(ctDNA)的癌症特异性甲基化模式已被研究成为癌症中可行的生物标志物。最近的研究表明，ctDNA有可能通过非侵入性的“液体活检”来彻底改变癌症的筛查、诊断和治疗，而且部分研究也表明，ctDNA甲基化标志物具有高度的敏感性和特异性，与肝癌患者的肿瘤负担、分期、治疗反应和预后相关，证明了无细胞DNA甲基化分析在HCC的诊断、治疗评估和预后中的作用，并为其在HCC以外的肿瘤中的广泛应用提供了概念上的证据[54]。

5 总结与展望

NAFLD疾病的严重性日益显现，DNA甲基化是NAFLD发生发展过程中的重要决定因素，与NAFLD的进展和纤维化的发展密切相关。上述研究表明，通过改变生活方式来调节表观基因组似乎能够逆转因饮食不当而造成的NAFLD，并有望通过发展一些无创操作检查技术如血源性生物标志物、液体活检等来鉴别早期及进展期NAFLD患者，改变NASH相关HCC的患者的筛查、诊断和治疗，在一定程度上减少NAFLD患者的痛苦，延缓疾病的发展，为NAFLD患者带去福音。