叶韬，李成文，高加胜，张海峰，李志坚

(九江市第一人民医院，江西 九江 332000)

前列腺癌是男性泌尿生殖系统中最为常见的恶性肿瘤之一。美国2018年估计新发164 690 例，死亡294 301 例[1]。我国男性前列腺癌发病率虽然较欧美国家低，但是由于人口老龄化、生活方式与饮食结构改变等原因，近年来呈现明显上升趋势[2]。研究[3]表明雄激素受体(AR)会促进前列腺癌的进展，AR的表达受DNA甲基化、蛋白泛素化以及MicroRNA(miRNA)等影响。MicroRNA是一类长度为19～24个核苷酸的非编码小RNA，具有发夹样茎-环结构，可参与调控mRNA的表达，多种重要的生物学过程(包括细胞增殖、凋亡、发育、分化和代谢)与miRNA密切相关[4]。最近研究[5-7]表明miR-506在结直肠癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤等进展中扮演重要角色。本研究拟通过转染miR-506 mimic观察前列腺癌细胞增殖、迁移能力的变化，进一步研究miR-506在前列腺癌中的作用，为前列腺癌提供新的治疗策略。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞

人前列腺癌细胞系LNCaP，C4-2，22Rv1，PC-3及Du145细胞为本实验室保存。

1.1.2 主要试剂和仪器

胰蛋白酶(Gibco公司，货号25200056)，二甲基亚砜(DMSO，Sigma公司，货号D2650)，Lipofectamine TM 2000试剂(赛默飞公司，货号11668019)，DEPC水(Invitrogen公司，货号AM9906)，Trizol试剂(天根生化科技有限公司，货号15596026)，cDNA逆转录试剂盒(赛默飞公司，货号12574018)，蛋白标准品(Thermo公司，货号69385)，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore公司，货号88520)，鼠抗AR(Abcam公司，货号ab133273)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)单克隆抗体(Abcam公司，ab181602)，胎牛血清(Sigma公司，货号1270548)，RPMI-1640培养基(Gibco公司，货号22400105)。miR-506 mimic及阴性对照均购于广州市锐博生物科技有限公司(货号miR10002878-1-5)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染

前列腺癌细胞系LNCaP，C4-2，22Rv1，PC-3及Du145细胞均在10%胎牛血清的高糖RPMI-1640培养液中培养，细胞转染按照Lipofectamine 2000试剂说明书进行。

1.2.2 细胞miRNA提取和miR-506的定量聚合酶链式反应检测

细胞miRNA提取按照mirVana miRNA提取试剂盒说明书进行。以miRNA为模板，逆转录生成cDNA，并用SYBR Green法进行定量聚合酶链式反应(PCR)，检测miR-506和内参照U6的水平。逆转录和定量PCR按照试剂盒说明书进行。引物序列如下。miR-506上游：TGCGGTAAGGCACCCTTCTGAGTAG，下游：CCAGTGCAGGGTCCGAGGT；U6上游：TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC，下游：CCAGTGCAGGGTCCGAGGT。miR-506的相对表达水平用2-ΔCt表示，其中ΔCt=CtmiR-506-CtU6。将细胞对照组的miR-506表达水平设为1，计算其他各组miR-506的相对表达水平。

1.2.3 MTT试验

将细胞按照每孔5×104接种于96孔板，每组设5个复孔。培养一定时间后，每孔细胞加入DMSO试剂150 μL，继续培养4 h后，采用酶标仪测定各孔在490 nm波长时的吸光度值，以各组平均值评估细胞活性。

1.2.4 划痕实验

将细胞接种到24孔板的3个孔中(每组设置3个复孔)，贴壁后用无菌的200 μL枪头垂直划痕，磷酸盐平衡生理盐水(PBS)清洗脱壁的细胞。划痕48 h后在显微镜下拍照并测量宽度。

1.2.5 迁移实验

将Transwell小室放入加有750 μL的10% FBS的培养基24孔板中，向小室中加入200 μL的细胞悬液，培养48 h后取出上室，吸除培养基，PBS清洗两次，用棉签轻柔拭去上室里面的细胞，无水甲醇固定15 min，取出小室翻转晾干10 min，0.1%的结晶紫染色20 min，PBS清洗两次，将小室放于24孔板里，置于倒置显微镜下照相，随机选取3个视野进行计数。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 miR-506在前列腺癌细胞中的表达

采用实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)检测miR-506在前列腺癌细胞系中的表达，结果显示：与LNCaP(0.445±0.053)细胞相比，C4-2，22Rv1，PC-3及Du145的miR-506表达均显著降低[(0.31±0.02)，(0.42±0.01)，(0.25±0.01)，(0.23±0.01)]，差异均有统计学意义(P<0.001)。

2.2 AR在前列腺癌细胞中的表达

同样应用qPCR检测AR在前列腺癌细胞系中的表达，结果显示：与LNCaP(0.445±0.053)细胞相比，C4-2和22Rv1的AR表达较多[(1.45±0.04)，(1.35±0.04)]，而PC-3及Du145细胞表达极少量的AR[(0.02±0.01)，(0.04±0.02)]，差异均有统计学意义(P<0.001)。

2.3 miR-506对细胞AR表达的影响

由于miR-506在C4-2细胞中表达较低，而AR表达较高，所以将miR-506 mimic转入C4-2检测AR的表达。结果发现，与对照组相比，AR的mRNA水平及蛋白表达均增加，差异有统计学意义(见图1)。

图1 C4-2细胞转染miR-506 mimic 后AR蛋白的表达

2.4 miR-506对细胞增殖能力的影响

MTT实验表明转染miR-506 mimic后，C4-2细胞的增殖能力降低，在72 h(3 d)时差异有统计学意义(P<0.01)(见图2)。

图2 C4-2细胞转染miR-506 mimic 后细胞增殖能力比较

2.5 miR-506对细胞迁移能力的影响

划痕实验表明过表达miR-506后，划痕48 h时划痕的愈合速度明显低于对照组(见图3)。迁移实验表明过表达miR-506后显著降低了C4-2迁移细胞数[(77±10) 个和(45±9)个]，差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 C4-2细胞转染miR-506 mimic 后细胞愈合能力比较

3 讨 论

MicroRNA在肿瘤的进展中发挥重要作用，可以通过调控CpG甲基化等影响一个或多个基因的表达，进而调节细胞信号通路，改变正常细胞生理，使其产生癌变，可能涉及细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、上皮间质转化、血管生成等过程[8]。文献报道[9]，至少160余种miRNA与前列腺癌进展相关，其中128种在肿瘤中表达增加(如miR-153，miR-92a，miR-182等)，38种表达下调(如miR-29a，miR-10a，miR-221等)。雄激素及其受体在前列腺癌中的具有重要作用。相对于PI3K/Akt，mTOR，BCL2等信号改变，miRNA对于AR的调控备受关注。研究[10]发现miR-34a，miR-135b，miR-185，miR-421，miR-449，miR-634，miR-9，miR-297等miRNA可与AR的3′-UTR结合，抑制其表达，我们通过在线预测软件(http：//www.targetscan.org)预测可能调控AR的miRNA，进一步结合文献筛选出本研究对象miR-506。

miR-506已被证实与多种癌症的发生有关。在肝癌细胞中，miR-506靶向作用于鞘氨醇激酶1(SPHK1) mRNA的3′-UTR区域，抑制SPHK1蛋白的表达，导致细胞悬浮液中1-磷酸鞘氨醇(S1P)减少，从而抑制肝癌的血管生成[11]。在胃癌中，长链非编码RNA NEAT1对肿瘤进展有促进作用，联合生物信息学、荧光素酶基因报告试验、RNA pull down等方法研究发现，miR-506可与NEAT1结合，且二者之间存在负向作用；此外，miR-506还可抑制STAT3 mRNA的表达，限制胃癌的进展，而miR-506抑制剂则可逆转其作用[12]。在卵巢癌中，miR-506抑制上皮间质转化转录因子SNAI2表达，后者抑制E-cadherin的表达，因而研究发现miR-506与E-cadherin的表达呈正相关，与N-cadherin及vimentin的表达呈负相关[13]。在乳腺癌中，miR-506在肿瘤组织中的表达较正常组织及良性组织下调，因而推测miR-506可能参与乳腺癌的病理过程，发挥类似抑癌基因的作用[14]。在本研究中，我们发现前列腺癌细胞过表达miR-506，会导致细胞增殖能力降低，迁移能力削弱，AR的RNA及蛋白表达受到抑制。提示miR-506可能通过抑制AR的表达抑制前列腺癌的进展。

MicroRNA对肿瘤的作用机制多种多样，依据其对肿瘤的作用，可以分为促进肿瘤进展的Oncogenic miRNA和抑制肿瘤进展的miRNA[15]。无论是促癌还是抑癌的miRNA，均可通过调节细胞周期蛋白、mTOR、PI3K信号调控细胞增殖，亦可通过调节TGF-β等信号调控细胞侵袭能力[8]。虽然miR-506在肿瘤细胞中的作用已有诸多报道[16-17]，但是其在前列腺癌中的作用尚未见报道。本研究明确miR-506对前列腺癌细胞增殖、转移的抑制作用，未来进一步探究其可能作用机制。

前列腺癌的治疗无论是在手术去势还是药物去势时期都围绕着AR展开，在激素敏感或雄激素抵抗时期也依赖于持续抗雄激素治疗[3]。目前对于激素抵抗的前列腺癌的治疗仍无有效办法。最近研究[18]表明，miR-99a-3p可通过负向调控非染色体结构维护凝缩蛋白Ⅰ复合体G亚基(NCAPG)抑制初发及去势，抵抗前列腺癌的进展。而细胞分泌外泌体中包含多种miRNA，如miR-517，miR-204，miR-885，miR-143，miR-335，miR-127等也参与前列腺癌的进展[19]。miRNA可能作为前列腺癌的标志物，对疾病的诊断、进展、预后等发挥作用[20]。可以预见，针对个体化的miRNA测定及靶向治疗可以给患者带来更好的治疗效果[21-22]。本研究发现miR-506可能对AR存在负向调控作用，其具体机制有待于进一步明确，推测可能是通过AR对前列腺癌发生、进展、转移等产生更多影响。

综上所述，miR-506可抑制前列腺癌增殖转移，进一步研究其作用可能为前列腺癌的诊断、治疗及预后带来新的方法策略。