朱海霞，蔺泽荣，马永强

(青海大学 农林科学院，青海大学 省部共建三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，农业部西宁作物有害生物科学观测实验站，青海省农业有害生物综合治理重点实验室，西宁 810016)

化学除草剂从应用至今已有70多年的历史，在提高农作物产量方面起到不可低估的作用[1]。但从20世纪70年代中期以来，抗药性杂草种类一直呈上升趋势[2-3]。同时，随着环境保护呼声的日益提高，高毒性农药的大量使用对农业生产及生态环境造成的负面影响已引起世界范围的广泛关注。为了保护人类生存环境和农业可持续发展，除草剂的研制与使用将严格受到环境和生态的制约[4]。利用杂草病原微生物代谢产物中的活性物质作为先导化合物，开发微生物源除草剂，是新型除草剂研究的重要方向[5]。利用微生物等新型生物研发新型除草剂已经迫在眉睫。

已报道的具有一定除草活性并有望开发成微生物除草剂的真菌代谢产物有100余种，涵盖近20个属[6]。Miwa等[7]通过发酵液分离提取技术，从海洋中的一株枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中获得两种具有抑制稗草生长的活性化合物新小环内酷类化合bacilosarcins A和B。Vikrant等[8]对茎点霉(Phomaherbarum)的代谢产物进行研究，从中分离到的3-硝基邻苯二甲酸，对银胶菊表现出很强的除草活性。这些研究都为新型微生物源除草剂的发掘和除草活性的先导化合物的探索奠定了基础。

研究事实证明，具有除草活性微生物中蕴含着大量的天然活性产物，对这些天然活性化合物构效关系及其除草机制的持续研究，为新型除草剂研发开辟了有效途径。此外，尽管有数以万计的微生物被发现和鉴定，但仍然有超过现有已知10倍以上的微生物尚未被研究。因此，从大量微生物中开发生防除草产品潜力巨大[9-10]。

多孢木霉(Trichodermapolysporum)HZ-31菌株是近来研究发现的对青海农田杂草藜(ChenopodiumalbumL.)、野燕麦(AvenafatuaL.)、密花香薷(ElsholtziadensaBenth)、萹蓄(PolygonumaviculareL.)、薄蒴草[Lepyrodiclisholosteoides(C.A. Mey.)]、酸模叶蓼(PolygonumlepathifoliumL.)等具有广谱、高效除草活性的一种杂草病原真菌[11-12]。作物安全性结果表明，该菌株对青海省主栽作物——油菜严重致病[11]。为明确HZ-31菌株中除草活性物质，本研究选用野燕麦和油菜作为靶标杂草，利用该菌株的发酵液和发酵滤液进行除草活性对比，并在此基础上经过4种有机溶剂萃取后，测定萃取物对杂草叶片的致病效果，确定检测活性物质最佳有机相，为进一步研究其活性物质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：多孢木霉HZ-31菌株由青海省农业有害生物综合治理重点实验室分离保存，同时保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，编号为CGMCC No.12867。

供试植物：藜、野燕麦、密花香薷、萹蓄、薄蒴草、酸模叶蓼、冬葵、油菜。

供试培养基：PDA培养基，配方为去皮马铃薯 200.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂18.0 g，蒸馏水 1 000 mL。

1.2 多孢木霉HZ-31菌株发酵培养及活性物质生测

1.2.1 多孢木霉HZ-31菌株发酵液和发酵滤液的制备 将多孢木霉菌株的斜面菌种制备成菌悬液，以φ=2%的接种量接种于PDB培养液，置智能恒温摇床(ZWY-1102)23 ℃、150 r/min振荡培养8 d，获得发酵液[12]。发酵液用4层纱布过滤，去除菌丝体及杂质。于4 000 r/min离心30 min，获得上清液。于4 ℃冰箱中静置24 h后离心，去除沉淀物，获得发酵滤液。

1.2.2 多孢木霉HZ-31菌株发酵液及发酵滤液对野燕麦和油菜种子萌发的影响 采用培养皿滤纸发芽法进行试验。选取饱满完整的野燕麦和油菜种子，用无菌水冲洗消毒。在直径为9 cm 的培养皿中铺上滤纸，分别加入待测生防菌发酵液及发酵滤液5 mL，每皿置20粒种子进行种子萌发试验，每处理重复3次，以无菌水发芽处理作为对照。25 ℃条件下黑暗培养，每天打开盖子通气1 h，隔天每个培养皿补充相应处理液5 mL，采用ISTA规定的方法于第3天进行首次计数，之后每天1次，第7天进行末次计数。

以种子发芽长度超过种子本身长度作为种子萌发的标准，种子萌发抑制率计算公式为。

发芽率=第7天正常发芽种子总数/测试种子总数×100%。

种子萌发抑制率=(对照种子萌发率-处理种子萌发率)/对照种子萌发率×100%。

1.3 不同有机溶剂萃取物活性测定

1.3.1 不同有机溶剂萃取 参照“1.2.1”中的方法获得发酵滤液，采用正丁醇、石油醚、氯仿、乙酸乙酯4种不同极性有机溶剂对4 L多孢木霉发酵滤液分别进行等体积萃取。振荡充分混合，静置过夜待分层后以分液漏斗将有机相与水相分开。萃取3次，合并相同有机相。利用旋转蒸发仪 (EYEL)，正丁醇相45 ℃下旋转蒸发，石油醚相和氯仿相37 ℃下减压旋转蒸发，乙酸乙酯相 34 ℃下旋转蒸发，各萃取相旋蒸至有机溶剂全部挥发，粗提物浓缩获得浸膏。各有机相浸膏用甲醇预溶后，再加入蒸馏水进行溶解，配制成 5 mg/mL和3 mg/mL粗提物溶液，备用。

采用离体叶片接种法和种子萌发法测定除草活性，判断其活性物质的极性。采用离体叶片接种法和种子萌发法进行活性追踪，根据叶片受侵染状况及种子萌发抑制率确定除草活性物质极性组分。

1.3.2 离体叶片处理法测定除草活性 田间采集新鲜的野燕麦、冬葵、密花香薷、萹蓄、酸模叶蓼、薄朔草、藜杂草的叶片，置于自封袋后带回室内用流动水冲洗，7种杂草叶片取各一片盛放在已灭菌并铺有滤纸的大培养皿(φ=15 cm)中，采用针刺法将不同有机溶剂粗提物5 mg/mL溶液50 μL定量滴加在叶片上，以滴加甲醇的处理作为对照组。每处理重复3次。置于室温自然光下，对7种供试杂草叶片受侵染状况进行不定期观测，通过叶片发黄、失绿、枯萎等病害症状确定侵染程度。比较4种极性有机溶剂粗提物对不同杂草叶片的离体致病性。

1.3.3 种子萌发处理法测定除草活性 将种子整齐摆放于铺有滤纸的种子培养皿中，每皿野燕麦种子4粒、油菜种子8粒，加入浓度为5 mg/mL的各有机相粗提物溶液各100 μL，为减少溶剂对种子萌发的影响，粗提物溶液滴加到滤纸上，待滤纸完全干后再均匀滴加0.5 mL灭菌水，每个处理5次重复，甲醇作为空白对照。25 ℃±1 ℃下黑暗培养，5 d后统计发芽率和抑制率。

将滤纸平铺在经灭菌处理的玻璃培养皿中，野燕麦种子20粒，油菜种子20粒，分别加入各有机相浓度3 mg/mL粗提物溶液各100 μL，待滤纸完全干后再均匀滴加3 mL灭菌水，每个处理3次重复，甲醇作为空白对照。25 ℃±1 ℃下黑暗培养，5 d后统计发芽率和抑制率。

2 结果与分析

2.1 多孢木霉HZ-31发酵培养及活性物质生测

由表1可以看出，HZ-31菌株发酵液对野燕麦和油菜的种子萌发抑制率分别为70.00%和86.67%，HZ-31菌株发酵滤液对野燕麦和油菜的种子萌发抑制率分别为80.00%和91.67%。对胚根、胚芽生长抑制作用明显(图1)。菌株发酵液和发酵滤液处理后，野燕麦和油菜的种子发芽率和萌发抑制率差异显著，二者的胚芽和胚根抑制率无显著差异。说明活性物质存在于发酵滤液和发酵液中，且发酵滤液中活性高于发酵液。

表1 HZ-31菌株发酵液及发酵滤液处理下野燕麦和油菜种子萌发Table 1 Seed germination of A.fatua and B.napus treated with fermentation broth and filtrate of strain HZ-31

2.2 不同有机溶剂萃取物除草活性分析

离体叶片接种法除草活性：用5 mg/mL的乙酸乙酯相、正丁醇相、石油醚、氯仿相分别处理7种杂草叶片，粗提物溶液处理1 d后，杂草叶片出现黄化，部分叶面变褐(图2)。正丁醇粗提物对密花香薷、酸模叶蓼、冬葵离体叶片具有强烈的致病性，侵染后的病斑面积占整个叶面积的60%以上。对野燕麦、萹蓄、薄蒴草有中度侵染，病斑面积占整个叶面积的16%～59%。对藜有轻度侵染。乙酸乙酯相粗提物对藜和萹蓄叶片有轻微的致病性，对其余5种杂草叶片表现出中度侵染。石油醚相粗提物对藜、萹蓄和酸模叶蓼叶片有轻微的致病性，对其余4种杂草叶片表现出中度侵染。氯仿相粗提物对密花香薷和薄蒴草叶片有轻度侵染，对野燕麦和冬葵叶片有中度侵染(表 2)。结果表明不同有机相致病效果由强到弱表现为正丁醇相>乙酸乙酯相>石油醚>氯仿相。确定最佳活性组分在正丁醇相中。

表2 4种极性有机溶剂粗提物对不同杂草离体叶片的致病性(处理后1 d)Table 2 Pathogenicity of four organic solvent extracts on different weeds in vitro(1 d after treatment)

正丁醇相处理1 d后，杂草叶片超过1/3叶面积出现黄化并产生病斑，处理3 d后，超过1/2叶面积失绿变褐，处理5 d后4/5叶片失绿，整个叶片枯黄萎蔫，其上产生白色霉层(图2)。

种子萌发法除草活性：4种有机溶剂萃取相粗提物5 mg/mL溶液对野燕麦和油菜种子萌发均有强烈的抑制作用，除乙酸乙酯外，其余处理完全抑制胚芽、胚根生长，发芽抑制率为100%，无显著性差异(表 3)。

表3 4种有机相粗提物对野燕麦、油菜种子的抑制Table 3 Inhibition of four kinds of organic fraction crude extracts on seeds of A.fatua and B.napus

4种有机相粗提物溶液对种子萌发的抑制作用表明，3 mg/mL浓度下正丁醇相粗提物能完全抑制野燕麦和油菜种子的萌发，而该浓度下乙酸乙酯相粗提物对野燕麦种子发芽抑制率为 16.67%，对油菜种子发芽抑制率为53.70%。石油醚相和氯仿相粗提物对野燕麦种子发芽抑制率分别为25.92%和29.63%，对油菜种子发芽抑制率分别为62.97%和42.59%(表 3)。乙酸乙酯相、石油醚相氯仿相之间抑制率不存在显著差异，正丁醇相与其他3种有机溶剂相相比差异显著，因此，粗提物活性测定以离体叶片生测法和种子萌发结果为依据，确定最佳活性组分在正丁醇 相中。

3 讨论与结论

萃取为从液相中提取分离有效成分的最常用手段。该方法是利用溶质在两个互不相溶液相中溶解度的差异，将目的化合物从液体混合物中分离开来[13-14]。针对HZ-31菌株代谢产物中有效成分在两相体系中的溶解的情况进行分析，挑选出可以用于萃取的溶剂。本研究选取正丁醇、乙酸乙酯、石油醚、氯仿这4种有机溶剂进行萃取试验，进而判断其活性物质的极性。

多孢木霉菌株在高温高湿条件下发病, 通过侵染植物引起腐烂,但是关于其产生的除草活性物质，目前未见报道。本研究发现HZ-31菌株发酵滤液对野燕麦和油菜的种子萌发抑制率分别为80.00%和91.67%，对胚根、胚芽生长抑制作用显著，且发酵滤液活性高于发酵液。不同有机溶剂萃取物对7种杂草叶片的致病效果由强到弱表现为：正丁醇相>乙酸乙酯相>石油醚>氯仿相。5 mg/mL正丁醇粗提物对密花香薷、酸模叶蓼、冬葵离体叶片具有强烈的致病性，处理5 d后4/5叶片失绿，整个叶片枯黄萎蔫。4种有机溶剂萃取相粗提物5 mg/mL溶液对野燕麦和油菜种子萌发均有强烈的抑制作用，3 mg/mL浓度下正丁醇相粗提物能完全抑制野燕麦和油菜种子的萌发。因此，粗提物活性测定以离体叶片生测法和种子萌发结果为依据，确定最佳活性组分在正丁醇相中。

利用杂草病原微生物代谢产物中的活性物质作为先导化合物，开发微生物源除草剂，是新型除草剂研究的重要方向[5]。筛选、利用和开发该类代谢产物，是目前杂草生防领域研究的热点。Javaid等[14]报道哈茨木霉(T.harzianumRifai)、拟康氏木霉(T.pseudokoningiiRifai)、里氏木霉(T.reeseiSimmons)、绿色木霉(T.viridePers)的粗提物对麦田杂草小子虉草(PhalarisminorL.)、齿果酸模(RumexdentatusL.)有较好的抑制活性；Cimmino等[15]发现拟茎点霉属(Phomopsissp.)产生的毒素可以防治澳大利亚马红花(Carthamuslanatus)等。这些研究都为发掘新型天然产物农药和寻找具有除草活性的先导化合物奠定了基础。

微生物发酵产物常常是伴有许多化合物的混合体，有效活性物质可能只是其中的一种或几种，因此，分离纯化是能够将目的产物进行结构和性质研究的前提[16]。本研究通过离体叶片生测法和种子萌发法对多孢木霉HZ-31菌株活性物质进行了初步分离，并对除草活性进行了研究，下一步有望通过薄层层析、柱层析、高效液相色谱HPLC方法等分离分析技术对多孢木霉HZ-31菌株发酵液中的除草活性物质进行分离纯化，逐步明确发酵液中除草作用的成分，并对其化学结构进行鉴定。