陈进城，何 坚，张圆芳，陈乐春，江 煜，张幻真，蒋晶晶，林志刚*，陈水金

（1.福建中医药大学附属康复医院，福建 福州350003；2.福建省康复技术重点实验室，福建 福州350003；3.福建中医药大学康复医学院，福建 福州350122；4.湖州市南浔区人民医院，浙江 湖州313000）

据研究数据统计，颈痛（neck pain，NP）是全球常见的骨骼肌肉疾病，是全球第四大致残障原因，NP发病率约16.2%［1-2］。颈型颈椎病（neck type of cervical spondylosis，NTCS）是NP中最常见疾病之一，NTCS的发病率逐年增高，并出现了显著年轻化的趋势，患病率高、持续时间长，并导致一系列心理和社会问题，严重影响患者生活质量，给社会造成一定程度的经济负担，是医学界关注的焦点［3-4］。研究表明，NTCS的主要病理性改变是颈部局部肌肉痉挛、水肿及炎症浸润等［5］。推拿治疗作为一种外治法，在治疗患者疼痛时显示出其具有简、便、验、廉、副作用少等诸多优点。本研究通过观察造模前、造模后及治疗后各组NTCS兔炎性痛阈值及血清、背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）中TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子的影响，从神经电生理及分子生物学的角度，探讨了推拿治疗NTCS的可能机制，为临床上运用推拿治疗NTCS镇痛机制提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物6月龄新西兰大白兔40只，雌雄各半，体质量3.0～3.5 kg，由福建中医药大学动物实验中心提供。合格证号：SYXK（闽）2019-0007。按照实验动物饲养标准常规饲养，动物自由进食和饮水，其饲养过程条件均一致。

1.2 主要仪器与试剂 无线触觉力按摩指套（日本FingerTPS公司）；颈椎病兔固定器（苏州市苏杭科技器材有限公司）；高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；TNF-α、IL-1β、IL-6的ELISA检测试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司）；PBS溶液（美国Hyclone公司）；微量移液器（德国Eppendorf公司）。

2 实验方法

2.1 造模 采用随机数字表法将新西兰大白兔随机分为空白组、模型组、触摸组、推拿手法组，每组各10只。适应性常规饲养1周后，参照文献［6-7］，模型组、触摸组、推拿手法组采用低头位兔颈后部敷冰块或自制冰袋刺激的方法建立兔NTCS模型，具体操作方法如下：将家兔置于固定器当中，兔低头屈曲45°，使其后颈部肌肉呈牵拉状态，在后颈部位敷上自制的保湿冰袋，并将吹风机出风口对着兔颈部吹。每次操作2 h，每日2次，连续造模4周。每天操作结束后，将各组家兔放回笼中，常规单笼饲养，自由饮食。空白组家兔在其他组造模期间同时置于兔子固定盒中，允许其颈部处于自由活动状态，不做任何其他干预。

模型评估：①造模后，除空白组外，其余各组兔血清炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平升高者为造模成功；②模型兔颈后肌硬度改变，出现条索状结节情况；③组织形态学改变，包括颈后肌肌细胞形态、肌原纤维排列及炎症细胞出现等情况。

2.2 干预 造模4周后进行干预，推拿手法组采用推拿按揉法：先将兔置于推拿固定床15 min，适应环境，施术者拇指带上无线触觉力按摩指套，拇指罗纹面置于兔大椎穴（第七颈椎棘突下凹陷处），进行按揉，按揉力度最大为10 N，频率为120次／min。触摸组采用手指抚摸法：先将兔置于推拿固定床15 min，适应环境，拇指带上无线触觉力按摩指套，拇指罗纹面对兔大椎穴进行节律性抚摸，力度最大为0.5 N，频率为120次／min。每日操作1次，每次10 min，连续干预18 d。空白组、模型组不做任何干预。

2.3 取材 各组兔子取血液后，用10 mL型号注射器吸入7～10 mL容量的空气，用耳缘静脉空气栓塞处死兔子，快速在兔后颈部皮下经筋起止点附近触及到条索状、硬结、有摩擦感的部位剪取肌肉组织，大致在下颈段颈3～6棘突旁约1 cm处，取肌肉组织约1 cm3（避免过度用力钳夹）。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 一般情况观察 观察家兔实验期间的一般状况，如毛色、饮食、活动等情况变化。

2.4.2 兔颈后肌肉硬度变化 观察各组家兔在造模和治疗过程中肌肉硬度的变化及有无条索状。

2.4.3 痛阈值测定 参照文献［8］测量痛阈值的方法，设电刺频率400 Hz，持续时间10 s，电流从0 mA逐渐加大，大白兔出现嘶叫时的电流值记录为痛阈值。于造模前、造模完成后、治疗后均测取2次，每次间隔时间20 s，计算平均值记录并比较。

2.4.4 血清炎性因子的测定 于造模结束后第2天和治疗后第2天这两个时间点，兔盒固定兔子后，对所有兔用一次性采血针进行耳缘静脉采血。血液置于采血管内，并及时置于4℃环境下离心，然后吸取上清，做好标记，并置于-80℃冰箱保存备用。采用酶标仪检测炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平。

2.4.5 DRG炎性因子的测定 分别于造模结束后第2天和治疗后第2天处死兔子，并迅速取出兔子右侧C6、C7、T1的DRG。置于管内，并及时置于4℃环境下离心，然后取得上清液，做好标记，并置于-80℃冰箱保存备用。测定DRG中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平变化，酶标仪检测［9］。

2.5 统计学方法 使用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，组间比较采用单因素方差进行分析，若方差齐采用LSD方法，方差不齐采用Games-Howell方法；不符合正态分布的数据采用非参数检验方法。

3 结 果

3.1 一般情况 各组大白兔在造模前毛色有光泽、反应灵敏、活动度与饮食可；造模期间，模型组、触摸组、推拿手法组大白兔逐渐出现毛色变黯、反应稍迟钝、活动度与饮食均减少，体质量增长速度较正常组缓慢；治疗期间，推拿手法组大白兔一般情况逐渐改善，体质量增长速度较模型组加快。

3.2 兔颈后肌肉硬度变化情况 空白组大白兔颈后部肌肉柔软有弹性，未触及肌肉里有明显的条索或硬结。模型组、触摸组、推拿手法组大白兔造模结束时颈后肌肉明显，呈条索状肌痉挛；治疗后推拿手法组较模型组颈肌条索明显变少，显著改善。

3.3 4组大白兔造模前、造模后、治疗后痛阈值比较 见表1。

表1 4组大白兔造模前、造模后、治疗后痛阈值比较（±s）mA

表1 4组大白兔造模前、造模后、治疗后痛阈值比较（±s）mA

注：与造模前比较，1）P＜0.05；与造模后比较，2）P＜0.05；与空白组比较，3）P＜0.05；与模型组比较，4）P＜0.05；与触摸组比较，5）P＜0.05。

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3.4 4组大白兔血清TNF-α、IL-1β、IL-6浓度比较 见表2。

表2 4组大白兔血清TNF-α、IL-1β、IL-6浓度比较（±s）pg／mg

表2 4组大白兔血清TNF-α、IL-1β、IL-6浓度比较（±s）pg／mg

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05；与触摸组比较，3）P＜0.05。

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3.5 4组大白兔DRG中TNF-α、IL-1β、IL-6炎症因子浓度比较 见表3。

表3 4组大白兔DRG中TNF-α、IL-1β、IL-6浓度比较（±s）pg／mg

表3 4组大白兔DRG中TNF-α、IL-1β、IL-6浓度比较（±s）pg／mg

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05；与触摸组比较，3）P＜0.05。

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4 讨 论

有关炎性痛的机制研究一直是疼痛及神经科学领域研究的热点之一。炎性痛是临床常见的病理性疼痛类型，其主要表现为持续性的痛觉过敏，如常见的颈型颈椎病、骨关节炎、类风湿性关节炎、肩袖损伤［10-11］。现代医学研究认为，NTCS属于颈椎病发病的早期表现，多见于青中年人群，也可称局部型颈椎病。NTCS是由于颈椎间盘退行性变的早期，颈肌防御性痉挛，其主要临床表现为颈肩部疼痛不适感及活动受限［12-13］。NTCS颈痛的发生与炎症因子密切相关，是常见炎性痛病症之一［5，14］。

推拿具有疏经通络、理气活血化瘀等作用，能有效缓解疼痛、消除肿胀，促进肌肉骨骼功能的康复［15-16］。推拿手法已经广泛应用于NTCS的治疗［17-18］，但其起效作用机制的实验研究还较薄弱，制约了推拿学科的进一步发展。因此，研究和揭示中医推拿手法对NTCS的作用机制，发现其镇痛的关键靶点是较为重要的问题。

采用低头架固定建立颈型颈椎病动物模型的方法不仅操作较为简便，且具有无创伤性的优势，没有损伤所观察组织，有利于后期进行干预和探讨推拿取效机制的研究［6-7］。本实验在造模过程中发现模型组、触摸组、推拿手法组大白兔有搔抓后颈部的动作，且越来越频繁，说明大白兔有颈部不适的症状表现，同时结合痛阈值和炎症因子指标也验证了此种造模方法是成功的；干预过程中推拿手法组兔搔抓后颈部的动作频率渐渐降低，说明推拿手法治疗能使家兔颈痛逐渐减轻。但仅通过观察家兔行为方面的变化，无法依据量化评估治疗效果，故本实验通过检测痛阈方法判定兔颈部疼痛程度的变化情况［8］。本研究在应用仪器检测家兔痛阈变化时，随着电流的缓慢变大，先出现挣扎摆头动作，接着出现嘶叫声，本研究将嘶叫时的电流值作为标准，每次测量均量取2次，以平均值记录为痛阈值。说明推拿手法能通过抑制血清及DRG中炎症因子的表达提高家兔疼痛阈值，减轻家兔颈部疼痛，效果明确。

NTCS是颈椎病发病过程中早期的病理、生理学改变，由于颈椎相关肌肉发生损伤后出现痉挛，导致周围软组织产生炎症反应而出现渗血、水肿、炎症浸润及粘连等，而TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子所致生物化学平衡的破坏是发病的主要原因［19］。何坚［5］通过检测NTCS兔模型血清中相关炎症因子的表达水平，发现造模后NTCS模型兔炎症因子的表达均显著升高，证实NTCS的发生、发展与炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达有着密切的联系。化学刺激是导致疼痛出现的重要因素之一，减弱炎性因子表达水平能减轻疼痛［20］。说明推拿手法这种治疗方法可以抑制NTCS家兔血清及DRG中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表达，减轻组织渗血、水肿、炎症浸润及粘连，进而提高家兔疼痛阈值，减轻家兔颈部疼痛。

综上所述，推拿手法可以减轻NTCS家兔颈部疼痛的症状，其作用机制可能与抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎症因子的表达密切有关。