马 超 张 韬 林润台 周 炼 翟海昕 朱智慧 赵继志

口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是头颈部最常见的恶性肿瘤之一，它具有颈部淋巴结转移、远处转移率高的特点。在我国每年约有4.56万新发口腔鳞状细胞癌病例，其中16%～55%的患者伴有颈部淋巴结和远处部位转移[1，2]。研究表明，OSCC患者如伴有同侧或对侧单个颈淋巴转移，患者术后生存率较未转移患者降低50%[3]，是导致患者预后差的主要原因。因此探究癌细胞侵袭、转移过程中的新机理，对OSCC转移性病例的有效治疗具有重要的意义。

CCL5（C-C chemokine ligand 5）是一种重要的趋化因子，它能够通过招募肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages，TAMs）促进肿瘤的发生发展[4]。TAMs是肿瘤微环境中最丰富的炎症细胞之一，其分泌的趋化因子（例如CCL5）是介导TAMs和癌细胞交联的重要载体。研究表明，来源于巨噬细胞的CCL5可以促进前列腺癌干细胞的生长和转移[5]。因此，通过抑制CCL5阻断TAMs与癌细胞的交联，可能成为恶性肿瘤转移的潜在治疗靶点。本研究旨在探究TAMs来源的CCL5在OSCC转移中的重要作用机制，以期为OSCC转移的治疗提供新的靶点和理论依据。

资料和方法

1.临床资料：选取北京协和医院口腔颌面外科2015年4月至2019年12月收集资料完整的OSCC患者81例，所有患者术前均未接受化疗或放疗，术中留取肿瘤原发灶和癌旁组织（对照）样本。本研究经北京协和医院伦理委员会批准，所有病例均明确诊断，所有参与者均知情同意。

2.免疫组化方法及判定标准：免疫组织化学检测按照文献所述的方法进行[6]，一抗分别为CCL5抗体（1∶100 dilution，ab9679，Abcam），CD163抗体（1∶100 dilution，ab51037，Abcam）。免疫组化结果由两位病理学家采用免疫应答评分法（IRS）评估。

3.细胞培养：本研究使用两株OSCC细胞系（CAL27和SCC-9）以及人急性单核细胞白血病细胞株THP-1（ATCC，Rockville，MD，USA）。THP-1细胞经320nM PMA以及20ng/ml IL-4（PeproTech，Rocky Hill，NJ，USA）处理20h后，诱导分化为TAMs。OSCC细胞株在RPMI培养基中添加10%血清白蛋白和1%青霉素/链霉素。细胞使用PBS、20μM ERK抑制剂（pd98059）、10μM P38抑制剂（sb203580）、CCR5单克隆抗体（Mab17959，Abnova）以及CCL5 siRNA（sc-44066，Santa Cruz）在无血清培养基中处理1h，检测细胞侵袭和蛋白表达。

4.免疫印迹：免疫印记检测按照文献所述的方法进行[6]。一抗使用Vimentin（1∶500，10366-1-ap，Proteintech）和E-cadherin（1∶500，ab40772，Abcam）抗体。

5.免疫荧光：按照文献所述[6]采用免疫荧光法检测口腔鳞癌组织中CCL5和TAMs标志物CD163的共定位。

6.统计学处理：统计分析使用SPSS 19.0（Chicago，IL，USA）和Graphpad Prism（La Jolla，CA，USA）统计软件。CCL5和CD163表达相关性采用Spearman相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

结果显示，CCL5和CD163在癌旁组织中均无表达，而在癌组织中高表达（图1A-F）。CCL5在转移肿瘤组织中的表达明显高于无转移肿瘤组织（IRS评分，4～9；P＜0.001），与CD163的表达具有相似趋势（P＜0.001，图1A-F）。相关性分析发现，CCL5和CD163在39例患者中高表达，14例中低表达，两者表达显著相关（图1G），提示CCL5参与了TAMs诱导的口腔鳞癌转移。

图1 CCL5和CD163在OSCC组织中表达升高

笔者首次发现OSCC肿瘤组织中CCL5与CD163存在共定位（图2A-C），且在转移肿瘤组织中检测到显著增强的共定位信号（图2D-F），证实OSCC肿瘤微环境中的CCL5主要来源于TAMs而非肿瘤细胞。细胞实验发现，CAL27和SCC-9细胞与TAMs共培养后比未经TAMs共培养的细胞具有更强的侵袭能力（图3），在培养基中加入CCR5单抗（10g/ml）以及CCL5 siRNA能够显著降低TAMs诱导的OSCC细胞侵袭。这些结果表明TAMs来源的CCL5推动了OSCC细胞侵袭。

图2 CCL5和CD163在OSCC组织中共定位增加

图3 抑制CCL5降低了TAMs诱导的细胞侵袭

笔者发现，CAL27和SCC-9细胞与TAMs共培养可降低上皮标记物E-cadherin的水平，同时提高间充质标记物Vimentin的水平（P＜0.05）（图4）。ERK1/2和P38抑制剂显著降低E-cadherin的表达，同时增加了Vimentin的水平。结果表明TAMs来源的CCL5通过激活P38/ERK1/2通路，调节EMT转化，推动了TAMs介导的OSCC细胞的转移和侵袭。

图4 P38/ERK1/2通路参与了OSCC细胞EMT转化

讨 论

CCL5是TAMs与肿瘤细胞之间恶性循环的重要交联，已被证实在胃癌、结肠癌、前列腺癌以及黑色素瘤的转移和进展中有重要的推动作用[7]。笔者通过临床样本检测，首次发现OSCC组织中TAMs与CCL5存在共定位，证实OSCC肿瘤微环境中的CCL5主要来源于TAMs而非肿瘤细胞。同时发现有淋巴结转移的OSCC组织中CCL5及CD163的表达高于无淋巴结转移的肿瘤组织和癌旁组织，且两者的表达呈正相关。该结果与affymetrix微阵列数据集分析结果一致（GSE2280，GSE3524）[8，9]，证实TAMs来源的CCL5与OSCC的转移密切相关，在OSCC肿瘤治疗方面具有潜在应用前景。

笔者发现M2型巨噬细胞能够诱导OSCC细胞侵袭显著增加。给予CCL5 siRNA以及CCR5阻断抗体能够显著抑制肿瘤细胞的侵袭，这些结果再次佐证了TAMs来源的CCL5在OSCC细胞侵袭中起重要作用。口腔鳞状细胞癌是一种上皮来源恶性肿瘤，已有研究显示，TAMs来源的CCL5通过刺激上皮间充质转化（EMT）从而推动了肿瘤细胞的转移和侵袭[5]。笔者发现TAMs来源的CCL5能够下调OSCC细胞的E-cadherin表达同时上调波形蛋白Vimentin的表达，证实CCL5推动了EMT转化途径。研究发现，P38、MAPK和ERK通路的激活参与了口腔鳞状细胞癌EMT转化途径[10]。笔者证实p-ERK1/2和p-P38抑制剂明显阻断CAL27和SCC-9细胞的EMT转化。这些数据表明CCL5通过ERK1/2/p38信号通路，调节EMT转化，推动了OSCC细胞的侵袭。