胡晓峰，柴海全，贾林川，邵 露，刘晓晓，陈 野

青岛市中医医院药剂科，青岛 266071

植物内生真菌(plant endophyte)是指生活在健康植物组织体内或生活史的某一阶段生活在植物组织体内，对宿主植物没有引起明显病害症状的一类微生物菌群[1,2]。近几十年来，内生真菌已被证实具有合成独特的次级代谢产物的能力，成为近些年来天然产物领域研究的热点[2]。植物内生真菌次级代谢产物具有结构多样、活性显著的特点。目前已从内生真菌中发现了具有抑菌、杀虫、抗肿瘤、抗氧化等活性的次级代谢产物，涵盖了聚酮类(大环内酯类、醌类、氧杂蒽酮类等)、萜类、生物碱类、肽类等多种结构类型[3]。内生真菌在与宿主植物长期的协同进化过程中，能够产生与宿主相同或相似的活性成分[4]。因此，药用植物内生真菌的研究引起了人们越来越多的关注[5-7]。特别是从植物内生真菌中发现了众多抗肿瘤先导化合物或药物，如紫杉醇(taxol)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、喜树碱(camptothecin)等，表明从药用植物内生真菌中发掘新的抗肿瘤活性先导化合物具有较大的潜力。

太子参为石竹科植物孩儿参Pseudostellariaheterophylla(Miq) Pax的干燥块根，为我国常用传统中药，具有益气健脾、生津润肺等功效，用于治疗肺燥干咳、自汗口渴、脾虚体倦、食欲不振等症状[8]。与其他药用植物相比，关于太子参内生真菌分离鉴定的研究较少。Cai等[9]从太子参中分离获得18株内生真菌，其中有6株菌株发酵产物具有显著的抗肿瘤活性，3株菌株发酵产物具有较好的抗氧化活性。但是，目前缺乏对太子参内生真菌活性次级代谢产物的深入研究。为了研究内生真菌这一特殊的微生物资源，我们从太子参中分离获得了12株内生真菌，并对其次级代谢产物的多样性和活性进行了筛选分析。其中菌株AspergillusterreusTZS-201607次级代谢产物具有丰富的化学结构多样性。在抗肿瘤活性筛选中，该菌株马铃薯葡萄糖肉汤(PDB)发酵产物对HeLa细胞表现出一定的抑制活性(48 h抑制率>50%)。为从该菌株中获得具有抗肿瘤活性的次级代谢产物，本文对其化学成分及活性进行了进一步研究。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

主要仪器：UV-2700紫外分光光度计(Shimadzu公司，日本)；Agilent DD2-500 MHz型核磁共振波谱仪(Agilent公司，美国)，TMS内标；LTQ Orbitrap XL混合线性离子阱质谱仪(Thermo Scientific公司，美国)；Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪(配置PDA二极管阵列检测器，Waters公司，美国)；Waters 2545制备色谱仪(Waters公司，美国)；快速纯化制备液相色谱Flash Isolera one(Biotage公司，瑞典)；R-100型旋转蒸发仪(Buchi公司，瑞士)；MD 4C NT型化学隔膜泵(Vacuubrand公司，德国)。

主要试剂：Lobar LiChroprep RP-18硅胶(40～63 μm，Merck公司，德国)；葡聚糖凝胶Sephadex LH-20(Merck公司，德国)；薄层色谱GF254硅胶预制板和柱色谱用硅胶(100～200目和200～300目，青岛海洋化工厂)；色谱纯级和分析纯级乙腈、甲醇、二氯甲烷等有机溶剂(国药集团化学试剂有限公司)。

1.2 实验样品

供试菌株分离自2016年7月采集于临沂市河东区重沟镇万家湖村的太子参(标本编号20160722A，经中国农业科学院烟草研究所张鹏副研究员鉴定为太子参Pseudostellariaheterophylla(Miq) Pax)。将采集的太子参经表面消毒后，分离纯化得到内生真菌。通过形态学观察与ITS序列系统发育分析，将供试菌株鉴定为A.terreus。菌种保存于中国海洋大学海洋生命学院(编号：AspergillusterreusTZS-201607)。

将保藏于4 °C的菌株接种到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA，成分：马铃薯粉6 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂20 g/L)平板上进行活化，28 °C活化培养5～7天。然后用6 mm打孔器将菌体(含培养基)接种入装有400 mL马铃薯葡萄糖肉汤培养基(PDB，成分：马铃薯粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，葡萄糖15 g/L，氯化钠5 g/L)的1 L锥形瓶中。置于28 °C静置培养30天。

1.3 提取分离

发酵结束后，将发酵液与菌丝体分离。发酵液用乙酸乙酯萃取3遍，经减压浓缩后得到粗提物A共10.6 g。菌丝体经干燥后，采用高速分散器进行组织破碎，然后用超声波细胞破碎仪于95%乙醇中进行萃取。处理3遍后获得粗提物B共15.2 g。合并粗提物A和B得总浸膏25.8 g。

将获得的浸膏用100～200目硅胶拌样，经正相硅胶柱(200～300目)采用石油醚-乙酸乙酯(30∶1→1∶1，体积比V/V)和二氯甲烷-甲醇(20∶1→1∶1，V/V)依次梯度洗脱后经TLC和HPLC检测合并得到6个流份(Fr.1～Fr.6)。采用活性追踪的策略，以HeLa细胞为活性筛选模型，经48 h细胞培养后进行分析，发现流分Fr.3、Fr.4和Fr.5均表现出一定的活性(样品浓度为20 μg/mL时抑制率分别为62.5%、75.6%和59.3%)。因此，对上述3个流分进行了系统的分离纯化。流分Fr.3(1.6 g，石油醚-乙酸乙酯2∶1洗脱部分)经二氯甲烷-甲醇(50∶1、30∶1、10∶1，V/V)梯度洗脱，合并得到3个子流分(Fr.3.1～Fr.3.3)。Fr.3.1(0.5 g)经制备薄层层析(pTLC，展开体系为二氯甲烷-甲醇20∶1，80 mL)，然后经Sephadex LH-20柱层析(甲醇洗脱)纯化得到化合物2(5.6 mg)和15(6.3 mg)。Fr.3.2(0.2 g)使用半制备HPLC(甲醇-水45%∶55%，流速2 mL/min)分离得到化合物1(11.3 mg)。流分Fr.4(3.5 g，石油醚-乙酸乙酯1∶1洗脱部分)经常压Lobar LiChroprep RP-18(反相C18)柱层析，以甲醇-水梯度洗脱(10%→100%)，合并得到6个子流分(Fr.4.1～Fr.4.6)。Fr.4.3(1.0 g)经制备薄层层析(pTLC，展开体系为二氯甲烷-甲醇15∶1，40 mL)，然后经Sephadex LH-20柱层析(甲醇洗脱)纯化得到化合物6(8.8 mg)和11(5.0 mg)。Fr.4.5(0.2 g)经pTLC(展开体系为二氯甲烷-丙酮10∶1，40 mL)纯化得到化合物5(6.2 mg)。Fr.4.6(1.3 g)经硅胶柱层析(二氯甲烷-甲醇30∶1洗脱)，然后经Sephadex LH-20柱层析(甲醇洗脱)纯化得到化合物7(12.6 mg)、12(20.3 mg)和13(9.6 mg)。流分Fr.5(2.2 g，二氯甲烷-甲醇20∶1洗脱部分)经反相C18柱层析，以甲醇-水梯度洗脱(10%→100%)，合并得到4个子流分(Fr.5.1～Fr.5.4)。Fr.5.2(0.2 g)使用半制备HPLC(甲醇-水35%∶65%，流速2 mL/min)分离得到化合物3(20.1 mg)。Fr.5.3(0.2 g)经pTLC(展开体系为二氯甲烷-甲醇15∶1，40 mL)分离得到化合物4(7.8 mg)和8(9.9 mg)。Fr.5.4(1.1 g)经硅胶柱层析(二氯甲烷-甲醇40∶1洗脱)，然后经Sephadex LH-20柱层析(甲醇洗脱)纯化得到化合物9(6.8 mg)、10(16.2 mg)、14(7.7 mg)和16(15.2 mg)。

1.4 细胞毒活性测试

采用MTT法对分离获得的单体化合物进行细胞毒活性测试[10]。供试肿瘤细胞包括：人非小细胞肺癌细胞(A549)、人乳腺管癌细胞(BT-549)、人宫颈癌细胞(HeLa)、人肝癌细胞(HepG2)、人乳腺癌细胞(MCF-7)和人髓系白血病单核细胞(THP-1)。上述细胞均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。将待测样品分别设2、4、8、16、32和64 μg/mL共6个浓度梯度。取对数生长期的细胞分别接种在96孔板上，每孔加入不同浓度化合物100 μL，培养24～72 h后，在显微镜下观察细胞的形态。然后，每孔加入10 μL浓度为5 mg/mL的MTT，置于37 °C下反应4 h。弃去上清液，每孔中加入150 μL的DMSO振荡混匀。490 nm下用酶标仪测定每孔的OD值。以表阿霉素(epirubicin)为阳性对照。计算不同化合物的IC50值。

2 结果

2.1 菌株鉴定

菌株在PDA平板上初期为白色菌丝体，后变为黄色到褐色(图1)。其孢子小、圆形，地毯状，深褐色或褐色。将扩增的ITS序列在GenBank上进行BLAST比对，结果发现，该菌株与A.terreusEBF108(MF377552.1)、A.terreusJJGG-54(MK644096.1)、A.terreusGKF25(MK713427.1)等菌株相似度均为99%。因此，鉴定该菌株为土曲霉A.terreus(GenBank序列号：MW534402)。

图1 菌株A.terreus在PDA平板上的形态Fig.1 Morphology of strain A.terreus on PDA plate

2.2 结构鉴定

化合物1淡黄色固体；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：13.21(1H，s，8-OH)，7.48(1H，t，J= 8.3 Hz，H-6)，6.81(1H，dd，J= 8.3，0.7 Hz，H-5)，6.81(1H，d，J= 7.0 Hz，H-1′)，6.74(1H，dd，J= 8.3，0.7 Hz，H-7)，6.49(1H，dd，J= 2.0，2.6 Hz，H-4′)，6.42(1H，s，H-2)，5.44(1H，t，J= 2.6 Hz，H-3′)，4.78(1H，dt，J= 7.0，2.0 Hz，H-2′)，3.98(3H，s，1-OMe)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：181.3(s，C-9)，164.5(s，C-3)，163.3(s，C-1)，162.3(s，C-8)，154.9(s，C-10a)，154.0(s，C-4a)，145.4(d，C-4′)，135.6(d，C-6)，113.2(d，C-2′)，111.2(d，C-7)，108.9(s，C-8a)，106.5(s，C-4)，105.9(s，C-9a)，105.9(d，C-5)，102.5(d，C-3′)，90.5(d，C-2)，56.8(q，1-OMe)，48.0(d，C-1′)。以上核磁数据与文献[11]中基本一致，故鉴定化合物1为杂色曲霉素(图2)。

图2 化合物1～16的化学结构Fig.2 The chemical structures of compounds 1-16

化合物2淡黄色无定形粉末；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.60(1H，s，8-OH)，7.19(1H，d，J= 8.9 Hz，H-6)，6.83(1H，d，J= 7.2 Hz，H-1′)，6.68(1H，d，J= 9.0 Hz，H-7)，6.49(1H，dd，J= 2.7，2.2 Hz，H-4′)，6.44(1H，s，H-2)，5.51(1H，t，J= 2.7 Hz，H-3′)，4.86(1H，d，J= 7.1 Hz，H-2′)，3.99(3H，s，1-OMe)，3.92(3H，s，5-OMe)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：181.4(s，C-9)，164.7(s，C-3)，163.5(s，C-1)，155.5(s，C-8)，154.2(s，C-10)，145.4(d，C-4′)，144.9(s，C-13)，139.6(s，C-5)，120.7(d，C-6)，113.5(d，C-1′)，109.8(d，C-7)，109.7(s，C-11)，107.0(s，C-4)，106.3(s，C-12)，102.7(d，C-3′)，90.8(d，C-2)，57.9(q，5-OMe)，57.0(q，1-OMe)，48.3(d，C-2′)。以上核磁数据与文献[12]中基本一致，故鉴定化合物2为5-甲氧基柄曲霉素。

化合物3淡黄色油状物；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.65(1H，s，1-OH)，7.59(1H，t，J= 8.3 Hz，H-7)，7.30(1H，s，H-1)，6.90(1H，dd，J= 8.4，0.8 Hz，H-8)，6.79(1H，dd，J= 8.2，0.8 Hz，H-6)，5.61(1H，m，H-16)，5.09(2H，s，H-20)，4.45(2H，d，J= 7.2 Hz，H-15)，2.46(3H，s，H-14)，1.81(3H，s，H-18)，1.72(3H，s，H-19)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：184.4(s，C-13)，161.8(s，C-5)，155.6(s，C-12)，154.0(s，C-3)，152.6(s，C-9)，142.8(s，C-2)，139.1(s，C-17)，136.8(d，C-7)，134.3(s，C-4)，119.6(d，C-16)，119.4(d，C-1)，118.0(s，C-10)，110.5(d，C-8)，106.5(s，C-6)，72.2(t，C-15)，57.1(t，C-20)，25.9(q，C-18)，18.1(q，C-19)，17.7(q，C-14)。以上数据与文献[13]报道基本一致，故鉴定化合物3为variecoxanthone A。

化合物4淡黄色油状物；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：7.12(1H，d，J= 8.3 Hz，H-3)，6.58(1H，s，H-5)，6.38(1H，d，J= 8.3 Hz，H-4)，6.26(1H，d，J= 9.9 Hz，H-14)，5.43(1H，d，J= 9.9 Hz，H-15)，4.82(1H，s，H-22α)，4.60(1H，s，H-22β)，4.52(1H，br s，H-25)，4.18(1H，m，H-19α)，4.12(1H，m，H-19β)，2.33(1H，br d，J= 11.2 Hz，H-20)，2.10(3H，s，H-24)，1.69(3H，s，H-23)，0.99(3H，s，H-17)，0.93(3H，s，H-18)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：200.6(s，C-13)，161.4(s，C-10)，154.1(s，C-1)，146.4(s，C-11)，144.2(s，C-7)，142.1(s，C-21)，132.8(d，C-3)，128.3(s，C-6)，127.0(d，C-15)，126.3(s，C-12)，121.6(d，C-14)，121.3(s，C-9)，117.4(d，C-5)，113.5(s，C-8)，112.6(s，C-2)，111.7(t，C-22)，108.5(d，C-4)，76.8(s，C-16)，62.9(t，C-19)，61.5(d，C-25)，44.5(d，C-20)，27.3(q，C-17)，26.6(q，C-18)，22.2(q，C-23)，16.1(q，C-24)。以上数据与文献[14]报道基本一致，故鉴定化合物4为chryxanthone A。

化合物5黄色固体；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：13.54(1H，s，1-OH)，7.43(1H，d，J= 2.1 Hz，H-5)，7.19(1H，s，H-4)，6.75(1H，d，J= 2.0 Hz，H-7)，5.37(1H，d，J= 3.1 Hz，H-1′)，4.00(3H，s，8-OMe)，3.96(3H，s，6-OMe)，2.06(1H，m，H-2′α)，2.05(1H，m，H-4′α)，1.88(1H，m，H-2′β)，1.84(1H，m，H-4′β)，1.66(1H，m，H-3′α)，1.59(1H，m，H-3′β)，1.58(3H，s，H-6′)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：186.7(s，C-9)，182.5(s，C-10)，164.9(s，C-6)，162.7(s，C-8)，159.5(s，C-1)，159.5(s，C-3)，137.5(s，C-10a)，132.5(s，C-4a)，116.8(s，C-2)，115.2(s，C-8a)，110.0(s，C-9a)，107.0(d，C-4)，104.8(d，C-7)，103.9(d，C-5)，100.8(s，C-5′)，67.1(d，C-1′)，56.6(q，8-OMe)，56.0(q，6-OMe)，35.9(t，C-4′)，27.8(q，C-6′)，27.4(t，C-2′)，16.0(t，C-3′)。以上数据与文献[15]报道基本一致，故鉴定化合物5为6,8-di-O-methylaverufin。

化合物6黄色固体；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：13.57(1H，s，1-OH)，7.43(1H，d，J= 2.4 Hz，H-5)，7.20(1H，s，H-4)，6.76(1H，d，J= 2.4 Hz，H-7)，5.24(1H，s，H-1′)，4.06(1H，d，J= 2.4 Hz，H-2′)，4.01(3H，s，8-OMe)，3.96(3H，s，6-OMe)，2.19(1H，ddd，J= 11.8，6.7，2.9 Hz，H-3′α)，1.93(1H，m，H-3′β)，1.74(2H，m，H-4′)，1.63(3H，s，H-6′)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：186.7(s，C-9)，182.4(s，C-10)，165.0(s，C-6)，162.8(s，C-8)，159.7(s，C-1)，159.2(s，C-3)，137.4(s，C-10a)，132.9(s，C-4a)，115.1(s，C-2)，114.7(s，C-8a)，110.0(s，C-9a)，107.2(d，C-4)，104.8(d，C-7)，104.0(d，C-5)，100.8(s，C-5′)，71.3(d，C-1′)，65.2(d，C-2′)，56.6(q，8-OMe)，56.0(q，6-OMe)，30.8(t，C-4′)，27.6(q，C-6′)，23.2(t，C-3′)。以上数据与文献[16]报道基本一致，故鉴定化合物6为6,8-di-O-methylnidurufin。

化合物7黄色固体；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：13.76(1H，s，1-OH)，9.43(1H，s，3-OH)，7.39(1H，s，H-5)，7.19(1H，s，H-4)，6.73(1H，s，H-7)，4.94(1H，m，H-1′)，3.99(3H，s，8-OMe)，3.94(3H，s，9-OMe)，3.45(3H，s，1′-OMe)，1.83(1H，m，H-2′α)，1.75(1H，m，H-2′β)，1.49(1H，m，H-3′α)，1.39(1H，m，H-3′β)，1.26(2H，m，H-4′)，1.25(2H，s，H-5′)，0.86(3H，m，H-6′)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：186.7(s，C-9)，182.4(s，C-10)，164.9(s，C-6)，162.8(s，C-8)，162.2(s，C-1)，162.1(s，C-3)，137.4(s，C-10a)，133.0(s，C-4a)，119.0(s，C-2)，115.1(s，C-8a)，110.2(s，C-9a)，108.4(d，C-4)，104.8(d，C-7)，103.8(d，C-5)，79.6(d，C-1′)，58.0(q，1′-OMe)，56.6(q，8-OMe)，56.0(q，6-OMe)，34.6(t，C-2′)，31.6(t，C-4′)，25.0(t，C-3′)，22.5(t，C-5′)，14.0(q，C-6′)。以上数据与文献[17]报道基本一致，故鉴定化合物7为6,8,1′-tri-O-methyl averantin。

化合物8白色粉末；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.63(1H，m，H-3)，5.57(1H，br d，J= 4.9 Hz，H-6)，5.38(1H，br s，H-7)，0.94(3H，s，H-18)，0.63(3H，s，H-19)，1.03(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，5.17,5.24(2H，dd，J= 11.2，7.6 Hz，H-22/H-23)，0.83(6H，t，J= 7.1 Hz，H-26/H-27)，0.91(3H，d，J= 6.1 Hz，H-28)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：38.4(t，C-1)，32.0(t，C-2)，70.4(d，C-3)，40.8(t，C-4)，139.8(s，C-5)，119.6(d，C-6)，116.3(d，C-7)，141.3(s，C-8)，46.2(d，C-9)，37.0(s，C-10)，21.1(t，C-11)，39.1(t，C-12)，42.8(s，C-13)，54.5(d，C-14)，23.0(t，C-15)，28.3(t，C-16)，55.7(d，C-17)，12.0(q，C-18)，16.3(q，C-19)，40.4(d，C-20)，21.1(q，C-21)，135.5(d，C-22)，132.0(d，C-23)，42.8(d，C-24)，33.1(d，C-25)，19.6(q，C-26)，19.9(q，C-27)，17.6(q，C-28)。以上数据与文献[18]报道基本一致，故鉴定化合物8为(22E,24R)-ergosta-7,9(11),22-trien-3β-ol。

化合物9淡黄色粉末；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.73(1H，s，H-4)，6.03(1H，d，J= 9.5 Hz，H-6)，6.60(1H，d，J= 9.5 Hz，H-7)，0.96(3H，s，H-18)，0.99(3H，s，H-19)，1.05(3H，d，J= 6.4 Hz，H-21)，5.21(1H，dd，J= 14.1，7.2 Hz，H-22)，5.24(1H，dd，J= 14.1，8.3 Hz，H-23)，0.83(6H，t，J= 7.1 Hz，H-26/H-27)，0.93(3H，d，J= 6.6 Hz，H-28)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：34.1(t，C-1)，34.2(t，C-2)，199.5(s，C-3)，123.0(d，C-4)，164.4(s，C-5)，124.4(d，C-6)，134.0(d，C-7)，124.4(s，C-8)，44.3(d，C-9)，36.8(s，C-10)，19.0(t，C-11)，35.6(t，C-12)，44.0(s，C-13)，156.1(s，C-14)，25.4(t，C-15)，27.7(t，C-16)，55.7(d，C-17)，19.0(q，C-18)，16.6(q，C-19)，39.3(d，C-20)，21.2(q，C-21)，135.0(d，C-22)，132.5(d，C-23)，42.9(d，C-24)，33.1(d，C-25)，20.0(q，C-26)，19.7(q，C-27)，17.6(q，C-28)。以上数据与文献[19]报道基本一致，故鉴定化合物9为(22E,24R)-ergosta-4,6,8(14),22-trtraen-3-one。

化合物10白色粉末；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：4.03(1H，m，H-3)，5.63(1H，s，H-7)，0.59(3H，s，H-18)，0.93(3H，s，H-19)，1.03(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，5.15(1H，dd，J= 15.3，8.3 Hz，H-22)，5.23(1H，dd，J= 15.2，7.6 Hz，H-23)，0.82(6H，t，J= 7.0 Hz，H-26/H-27)，0.92(3H，d，J= 6.7 Hz，H-28)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：27.8(t，C-1)，30.3(t，C-2)，67.4(d，C-3)，38.7(t，C-4)，77.6(s，C-5)，198.7(s，C-6)，119.7(d，C-7)，165.6(s，C-8)，38.8(s，C-9)，42.8(s，C-10)，27.8(t，C-11)，33.0(t，C-12)，44.7(s，C-13)，55.8(d，C-14)，22.5(t，C-15)，27.7(t，C-16)，56.0(d，C-17)，12.7(q，C-18)，16.4(q，C-19)，40.3(d，C-20)，21.1(q，C-21)，135.0(d，C-22)，132.4(d，C-23)，43.8(d，C-24)，33.0(d，C-25)，19.6(q，C-26)，19.9(q，C-27)，17.6(q，C-28)。以上数据与文献[19]报道基本一致，故鉴定化合物10为(22E,24R)-3β,5α-dihydroxy-ergosta-7,22-dien-6-one。

化合物11白色粉末；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：3.95(1H，m，H-3)，5.64(1H，s，H-7)，0.67(3H，s，H-18)，0.99(3H，s，H-19)，1.06(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，5.24(1H，dd，J= 15.3，8.0 Hz，H-22)，5.30(1H，dd，J= 15.3，7.4 Hz，H-23)，0.85(6H，t，J= 6.9 Hz，H-26/H-27)，0.95(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：26.3(t，C-1)，31.2(t，C-2)，67.0(d，C-3)，37.6(t，C-4)，79.9(s，C-5)，197.9(s，C-6)，120.5(d，C-7)，163.4(s，C-8)，75.4(s，C-9)，42.4(s，C-10)，29.2(t，C-11)，35.8(t，C-12)，45.7(s，C-13)，52.2(d，C-14)，23.0(t，C-15)，28.7(t，C-16)，56.8(d，C-17)，12.5(q，C-18)，20.6(q，C-19)，41.2(d，C-20)，21.5(q，C-21)，136.3(d，C-22)，133.0(d，C-23)，43.7(d，C-24)，33.8(d，C-25)，20.0(q，C-26)，20.3(q，C-27)，18.1(q，C-28)。以上数据与文献[19]报道基本一致，故鉴定化合物11为(22E,24R)-3β,5α,9α-trihydroxy-ergosta-7,22-diene-6-one。

化合物12白色粉末；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：4.27(1H，m，H-3)，5.44(1H，d，J= 4.9 Hz，H-4)，6.18(1H，d，J= 9.7 Hz，H-6)，5.88(1H，d，J= 9.7 Hz，H-7)，0.99(3H，s，H-18)，0.84(3H，s，H-19)，1.07(3H，d，J= 6.7 Hz，H-21)，5.26(1H，dd，J= 14.9，7.4 Hz，H-22)，5.30(1H，dd，J= 14.7，6.7 Hz，H-23)，0.86(3H，d，J= 6.8 Hz，H-26)，0.87(3H，d，J= 6.8 Hz，H-27)，0.95(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)；13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：30.4(t，C-1)，26.9(t，C-2)，44.3(d，C-3)，124.1(d，C-4)，146.4(s，C-5)，127.2(d，C-6)，126.5(d，C-7)，125.8(s，C-8)，46.4(d，C-9)，36.5(s，C-10)，20.3(t，C-11)，37.6(t，C-12)，44.4(s，C-13)，149.8(s，C-14)，25.3(t，C-15)，28.7(t，C-16)，57.0(d，C-17)，19.6(q，C-18)，17.8(q，C-19)，40.3(d，C-20)，21.7(q，C-21)，136.5(d，C-22)，133.0(d，C-23)，43.9(d，C-24)，33.9(d，C-25)，20.1(q，C-26)，20.4(q，C-27)，18.2(q，C-28)，158.6(s，C-29)。以上数据与文献[20]报道基本一致，故鉴定化合物12为(22E,24R)-3α-ureido-ergosta-4,6,8(14),22-tetraene。

化合物13白色粉末；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：3.75(1H，m，H-3)，3.58(1H，br s，H-6)，5.06(1H，m，H-7)，0.52(3H，s，H-18)，0.89(3H，s，H-19)，0.97(3H，d，J= 6.5 Hz，H-21)，5.15(1H，dd，J= 15.3，8.1 Hz，H-22)，5.21(1H，dd，J= 15.3，7.2 Hz，H-23)，0.79(6H，t，J= 6.6 Hz，H-26/H-27)，0.87(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：31.6(t，C-1)，32.9(t，C-2)，66.4(d，C-3)，40.6(t，C-4)，74.9(s，C-5)，72.6(d，C-6)，119.9(d，C-7)，140.1(s，C-8)，42.7(d，C-9)，37.1(s，C-10)，21.8(t，C-11)，40.6(t，C-12)，43.4(s，C-13)，54.6(d，C-14)，23.0(t，C-15)，28.2(t，C-16)，55.8(d，C-17)，12.5(q，C-18)，18.2(q，C-19)，40.5(d，C-20)，21.4(q，C-21)，135.8(d，C-22)，131.8(d，C-23)，42.5(d，C-24)，32.9(d，C-25)，20.2(q，C-26)，19.9(q，C-27)，17.7(q，C-28)。以上数据与文献[21]报道基本一致，故鉴定化合物13为(22E,24R)-ergosta-7,22-dien-3β,5α,6β-triol。

化合物14白色粉末；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：3.93(1H，m，H-3)，6.48(1H，d，J= 8.5 Hz，H-6)，6.22(1H，d，J= 8.5 Hz，H-7)，0.79(3H，s，H-18)，0.82(3H，s，H-19)，0.89(3H，d，J= 6.8 Hz，H-21)，5.12(1H，dd，J= 15.3，8.3 Hz，H-22)，5.20(1H，dd，J= 15.3，7.6 Hz，H-23)，0.80(3H，d，J= 6.8 Hz，H-26)，0.88(3H，d，J= 6.8 Hz，H-27)，0.98(3H，d，J= 6.6 Hz，H-28)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：34.7(t，C-1)，30.0(t，C-2)，66.3(d，C-3)，39.3(t，C-4)，82.2(s，C-5)，135.2(d，C-6)，130.7(d，C-7)，79.4(s，C-8)，51.6(d，C-9)，36.9(s，C-10)，20.6(t，C-11)，36.9(t，C-12)，44.5(s，C-13)，51.6(d，C-14)，23.4(t，C-15)，28.6(t，C-16)，56.1(d，C-17)，12.9(q，C-18)，18.2(q，C-19)，39.7(d，C-20)，20.9(q，C-21)，135.4(d，C-22)，132.2(d，C-23)，42.7(d，C-24)，33.0(d，C-25)，19.6(q，C-26)，19.9(q，C-27)，17.6(q，C-28)。以上数据与文献[22]报道基本一致，故鉴定化合物14为(22E,24R)-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol。

化合物15白色固体；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：5.74(1H，d，J= 1.2 Hz，H-2)，0.52(3H，s，H-12)，0.98(3H，d，J= 6.6 Hz，H-14)，5.17(1H，dd，J= 15.3，8.2 Hz，H-15)，5.25(1H，dd，J= 15.3，7.4 Hz，H-16)，0.79(6H，t，J= 7.0 Hz，H-19/H-20)，0.88(3H，d，J= 6.8 Hz，H-21)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：171.1(s，C-1)，112.0(d，C-2)，171.1(s，C-3)，105.5(s，C-4)，35.2(t，C-5)，35.4(t，C-6)，48.7(s，C-7)，50.3(d，C-8)，21.3(t，C-9)，29.0(t，C-10)，55.1(d，C-11)，11.9(q，C-12)，40.0(d，C-13)，21.3(q，C-14)，135.4(d，C-15)，132.2(d，C-16)，42.5(d，C-17)，32.9(d，C-18)，19.9(q，C-19)，20.2(q，C-20)，17.8(q，C-21)。以上数据与文献[23]报道基本一致，故鉴定化合物15为demethylincisterol A3。

化合物16白色固体；1H NMR(500 MHz，DMSO-d6)δ：6.01(1H，s，H-2)，0.54(3H，s，H-12)，0.98(3H，d，J= 6.6 Hz，H-14)，5.17(1H，dd，J= 15.3，8.2 Hz，H-15)，5.25(1H，dd，J= 15.3，7.5 Hz，H-16)，0.79(6H，t，J= 7.2 Hz，H-19/H-20)，0.88(3H，d，J= 6.8 Hz，H-21)，2.99(3H，s，OCH3)；13C NMR(125 MHz，DMSO-d6)δ：170.4(s，C-1)，114.7(d，C-2)，169.1(s，C-3)，107.7(s，C-4)，34.6(t，C-5)，35.0(t，C-6)，48.7(s，C-7)，50.6(d，C-8)，21.1(t，C-9)，28.9(t，C-10)，55.1(d，C-11)，12.0(q，C-12)，40.0(d，C-13)，21.2(q，C-14)，135.4(d，C-15)，132.3(d，C-16)，42.5(d，C-17)，32.9(d，C-18)，19.9(q，C-19)，20.3(q，C-20)，17.8(q，C-21)，50.1(q，OCH3)。以上数据与文献[24]报道基本一致，故鉴定化合物16为(17R)-17-methylincisterol。

2.3 细胞毒活性测试结果

将分离获得的化合物1～16进行了细胞毒活性测试。以抗生素类抗肿瘤药表阿霉素(epirubicin)为阳性对照，以A549、BT-549、HeLa、HepG2、MCF-7和THP-1为供试细胞，活性结果见表1。化合物1～7、12、14～16对不同的肿瘤细胞表现出一定活性。其中，蒽醌类化合物6对A549和BT-549表现出较强的细胞毒活性，IC50值分别为9.8 ± 0.2和9.8 ± 1.3 μM。蒽醌类化合物7对HeLa表现出较强的细胞毒活性，IC50值为9.9 ± 1.1 μM。甾醇类化合物14对THP-1表现出较强的活性，IC50值为9.0 ± 0.5 μM。

表1 化合物的细胞毒活性

3 讨论与结论

药用植物与其内生真菌通过长期的协同进化，形成了独特的互惠共生关系。其中，宿主植物为真菌提供生长、保护场所和营养环境，而内生真菌通过合成次级代谢产物促进植物的生长及防御。由于这些次级代谢产物具有显著的生物活性，极具新药开发前景，因此药用植物内生真菌资源已被证实是一个亟待开发的宝库。近30年来，已经从数百种药用植物，如宁前胡、川芎、夹竹桃等，分离纯化了大量的内生真菌，表明药用植物中蕴含着丰富的内生真菌资源。太子参作为我国常用传统中药，其关于内生真菌分离鉴定的研究较少，目前仅从中分离获得了18株内生真菌[9]。因此，太子参内生真菌资源有待进一步深入发掘。

药用植物内生真菌能够产生结构多样的活性次级代谢产物，其中相当部分的次级代谢产物具有抗肿瘤药理活性，表现出潜在的应用价值。这些代谢产物的结构类型包括生物碱类、甾体类、萜类、黄酮类、蒽醌类等。蒽醌是天然醌类化合物中数量最多也是最重要的一类化合物，具有重要的生物活性，尤其抗肿瘤活性。其具有天然低毒、高效的特点，引起了研究人员广泛的关注。为了研究太子参内生真菌并从中获得活性显著的次级代谢产物，特别是发现具有抗肿瘤活性的化合物，本研究采用多种色谱技术从太子参内生真菌A.terreusTZS-201607中分离纯化得到16个化合物，分别为口山酮(化合物1～4)、蒽醌(化合物5～7)以及甾醇(化合物8～16)类化合物。本研究报道的化合物1～7、12、14～16为首次从内生真菌A.terreus中分离获得。在体外抗肿瘤活性测试中，化合物6、7和14对人肿瘤细胞株A549、BT-549、HeLa和THP-1表现出较强的细胞毒活性(IC50<10 μM)。本研究丰富了太子参内生真菌资源多样性，在一定程度上丰富了真菌A.terreus次级代谢产物化学结构类型和生物活性。同时，本研究发现了抗肿瘤活性显著的蒽醌类化合物，为后续药物先导化合物的发现和研究提供了化合物实体。