巨 凤，罗 凡，冯 丹，郭大乐，任 波，邓 赟

成都中医药大学药学院 四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验-省部共建国家重点实验室培育基地，成都 611137

冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)是线形虫草属(Ophiocordyceps)真菌冬虫夏草菌的子座与其寄主蝙蝠蛾科昆虫的幼虫尸体的复合体[1]，是分布在青藏高原高寒地区的特殊物种[2]。性平，味甘，归肺、肾经，具有化痰止血，补肺益肾等功效[3]。由于冬虫夏草独特的疗效使市场需求量增加，天然虫草被过度采挖，资源日益严峻，引起了人们的广泛关注。而中药内生菌通过长期的协同进化，可产生与宿主植物相同或相似的活性物质[4]，如已有研究报道从冬虫夏草中分离的中国被毛孢的菌丝体被研制成百令胶囊、蝙蝠蛾拟青霉的发酵菌丝体被开发为金水宝胶囊、蝙蝠蛾被毛孢被开发为至灵胶囊等[5]，因此冬虫夏草中的内生菌具有很大的研究潜力。

Penicilliumcrustosum为半知菌亚门半知菌纲壳霉目杯霉科(Discellaceae)青霉属(Penicillium)真菌。文献查阅P.crustosum次生代谢产物的研究集中在液体发酵，分离得到了一系列涵盖硫代二酮哌嗪类、苯二氮卓类、吲哚二萜类、喹啉类等类型的生物碱类化合物以及具有clavatol单元和γ-丁内酯单元的新颖结构的聚酮类化合物[6-7]。He等[8]从P.crustosum次级代谢产物中分离得到了3个新的硫代二酮哌嗪和2个类似物，这两个化合物分别在>8 μΜ和>16 μΜ的剂量下能促进尼罗红处理的斑马鱼的胃肠动力，进一步用阿托品做干扰表明化合物可能通过作用于胆碱能神经系统从而发挥功效；Liu等[9]从P.crustosum中分离得到一个新的多烯化合物、一个新的二酮哌嗪以及3个已知化合物，新的二酮哌嗪fusaperazine F对K562细胞(人慢性髓系白血病细胞)具有细胞毒作用，IC50值为12.7 μΜ；Feng等[10]从其液体发酵产物中分离得到了一对新的对映异构体及一个类似物和一个新的聚酮类化合物，其类似物对MV4-11(人髓性单核细胞白血病细胞)细胞有轻微的抑制作用，IC50值为36.23 μΜ。而对P.crustosum的大米固体发酵产物研究较少，为进一步丰富Penicilliumcrustosum代谢产物的化学信息和比较不同发酵方式对其次生代谢产物的影响，合理开发冬虫夏草的资源，本文利用多种色谱分离技术和现代波谱技术，采用大米固体发酵对虫草内生菌Penicilliumcrustosum进行培养并对其代谢产物进行化学成分研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器与试剂

Finnigan-LCQDECA质谱仪(美国赛默飞世尔公司)；Bruker Ascend 400核磁共振仪(TMS为内标，德国布鲁克公司)；中压层析柱(利穗科技(苏州)有限公司)；NP7000型制备型高效液相色谱仪(江苏汉邦仪器有限公司)；Axioscope 5生物显微镜(德国蔡司公司)；柱层析硅胶(300～400目)；薄层层析硅胶板(5×10 cm,G)(青岛海洋化工厂)；HPLC柱(Pack ODS-A,5 um,250×10 mm)(日本YMC株式会社)。三氯甲烷、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、甲醇(成都科龙化工试剂厂，均为分析纯)。

1.2 菌种来源

新鲜中药材采集于甘肃省夏河县，由成都中医药大学蒋桂华教授鉴定为冬虫夏草(Ophiocordycepssinensis)。从新鲜的冬虫夏草中分离得到一株内生真菌(编号：DCXC-20160503-XHX-20160908-2-1-1)，菌株在PDA平板上菌落前期为白色，然后变为灰绿色，分生孢子梗较短，从菌丝垂直生出，分生孢子球形，直径3.5～5.0 μm，光滑(见图1)。再测得其ITS基因和TUB2基因得到的18S rRNA基因序列提交到NCBI的GenBank基因库，经BLAST比对，相似度分别为100%(NO.MK285663)和99.49%(NO.MN418444.1)鉴定为Penicilliumcrustosum。具体引物见表1。药材样品和P.crustosum菌种现保存于成都中医药大学药学院生化制药实验室。

图1 P.crustosum菌株形态特征Fig.1 Morphological characteristics of P.crustosum strain注：A：菌落；B：菌丝体；C：分生孢子。Note:A:Colony;B:Mycelia;C:Conidia.

表1 引物序列表

1.3 培养基

实验所用的培养基配方如下：PDA培养基：去皮土豆200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂15-20 g/L。液体培养基：葡萄糖20 g/L，可溶性淀粉8 g/L，蛋白胨5 g/L，酵母膏2 g/L，氯化钠2 g/L，碳酸钙2 g/L，硫酸镁0.5 g/L，磷酸氢二钾0.5 g/L，pH自然。大米固体培养基：大米40 g/瓶，蛋白胨2 g/瓶，自来水40 mL。

2 实验方法

2.1 大米固体发酵

菌种活化传代，将在PDA培养基上纯化得到的P.crustosum菌株接种至液体培养基中，于摇床培养4天(28 ℃、200 rpm)，得到种子液，再将其转至灭菌后的300瓶发酵瓶中，瓶内装有大米固体培养基，室温下静置培养40天。

2.2 发酵产物的提取与分离

发酵完毕后，得到的发酵产物甲醇超声提取三次，减压浓缩得到浸膏，再用乙酸乙酯萃取，三次后合并萃取液并浓缩得到乙酸乙酯部位浸膏224.0 g。将其经正相硅胶柱层析，采用的洗脱体系为石油醚-丙酮(10∶0→1∶1)，收集洗脱液，TLC分析指导，合并得组分A(20.0 g)、B(5.5 g)、C(0.9 g)、D(29.4 g)、E(22.6 g)、F(43.5 g)、G(8.7 g)、H(2.1 g)。

组分C经葡聚糖凝胶柱层析，由三氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱，HPLC分析合并得5个亚组分C1、C2、C3、C4、C5。C2经HPLC制备，甲醇-水(60∶40)洗脱得到化合物13(9.2 mg)。

组分D经MCI柱层析，由甲醇-水(30∶70→100∶0)洗脱，HPLC分析合并得到20个亚组分D1、D2、D3～D20。D13经甲醇重结晶得到化合物4(6.1 mg)。D15经HPLC制备，甲醇-水(50∶50)洗脱得到化合物2(1.3 mg)、化合物3(2.6 mg)、化合物5(20.0 mg)。D20经HPLC制备，甲醇-水(70∶30)洗脱得到化合物6(4.6 mg)。

组分E经MCI柱层析，由甲醇-水(30∶70→100∶0)洗脱，HPLC分析合并得到29个亚组分E1、E2、E3～E29。E11经葡聚糖凝胶柱层析，由三氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱，HPLC分析合并得到组分E11-1、E11-2、E11-3、E11-4、E11-5。E11-5经HPLC制备，甲醇-0.05%乙酸水(38∶72)洗脱得到化合物9(4.2 mg)。

组分F经正相硅胶柱层析，由三氯甲烷-甲醇(100∶0→0∶100)洗脱，薄层分析指导，得到6个亚组分F1、F2、F3～ F6。F1经HPLC制备，甲醇-水(85∶15)洗脱得到化合物16(3.2 mg)。F3经MCI柱层析，由甲醇-水(20∶80→100∶0)洗脱，HPLC分析合并得到组分F3-1、F3-2、F3-3～F3-12。F3-3经葡聚糖凝胶柱层析，由三氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱，得到化合物10(4.2 mg)。

组分G经MCI柱层析，由甲醇-水(10∶90→100∶0)洗脱，HPLC分析合并得到8个亚组分G1、G2、G3～G8。G1经反相C8柱层析，由甲醇-水(5∶95→100∶0)洗脱，得到组分G1-1、G1-2、G1-3～G1-7。G1-2经HPLC制备，甲醇-水(15∶85)洗脱得到化合物14(5.0 mg)。G1-3经HPLC制备，甲醇-水(15∶85)洗脱得到化合物11(2.3 mg)、化合物12(3.1 mg)。G2经甲醇重结晶，得到化合物15(20.0 mg)。G8经葡聚糖凝胶柱层析，由三氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱，HPLC分析合并得到组分G8-1、G8-2、G8-3～G8-5。G8-4经HPLC制备，甲醇-水(60∶40)洗脱得到化合物1(11.0 mg)、化合物7(3.2 mg)、化合物8(6.7 mg)。

2.3 化合物的抑菌活性测试(滤纸片法)

对化合物1～16进行抑菌活性测验。测试细菌菌株为：革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisATCC 25952)、革兰氏阴性菌大肠杆菌(EscherichiacoliATCC 9372)。测试真菌菌株为：香蕉炭疽病菌(ColletotrichummusaeACCC 31244)、马铃薯炭疽病菌(ColletotrichumcoccodesACCC 36067)。采用的方法是药敏片扩散法。抑制细菌试验中，硫酸链霉素和甲醇分别作为阳性对照组和阴性对照组；抑制真菌试验中，放线菌酮和甲醇、无菌水分别作为阳性对照组和阴性对照组。

将细菌菌株在LB培养皿中37 °C下培养24 h进行活化，活化后加入无菌水配置成1.0 ×106CFU/mL的菌液，吸取1 mL菌液涂布到LB培养皿中；将真菌菌株在PDA培养皿中28 °C下培养48 h进行活化，活化后加入无菌水配置成1.0 ×106CFU/mL的菌液，吸取1 mL菌液涂布到PDA培养皿中。硫酸链霉素和化合物用甲醇配置为400 μg/mL的溶液，放线菌酮用无菌水配置为400 μg/mL的溶液备用。每个药敏片加6 μL样品，待溶剂挥干后，放置在培养皿中。细菌培养皿在37 °C中生长12 h后测量抑菌圈直径，真菌培养皿在28 °C中生长48 h后测量抑菌圈直径。每组实验平行3次求得平均值。

3 实验结果

3.1 结构鉴定

化合物1黄色油状(CHCl3)；ESI-MS：m/z307 [M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：0.95(3H，d，J= 6.7 Hz，H-11)，0.99(3H，d，J= 6.5 Hz，H-10)，1.56～1.51(2H，m，H-8)，1.71(1H，ddt，J= 14.9，13.1，6.6 Hz，H-9)，1.97(3H，s，H-13)，2.03～1.98(2H，m，H-4)，2.09～2.03(2H，m，H-4)，2.24～2.19(2H，m，H-3)，3.62(2H，ddd，J= 9.7，7.4，5.8 Hz，H-5)，3.72(3H，s，H-14)，3.83(2H，dt，J= 9.8，6.9 Hz，H-5)，4.49(1H，dd，J= 8.4，4.8 Hz，H-2)，4.82(2H，td，J= 8.9，5.2 Hz，H-7)，6.29(1H，d，J= 8.3 Hz，-NH)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：22.1(C-11)，23.3(C-13)，23.5(C-10)，24.8(C-9)，25.0(C-4)，29.2(C-3)，42.0(C-8)，47.0(C-5)，49.1(C-7)，52.4(C-14)，58.9(C-2)，170.1(C-12)，171.7(C-6)，172.5(C-1)。查阅文献[11]显示，该化合物与合成产物Ac-Leu-Pro-OCH3的波谱数据基本一致，该化合物的结构得以确定(图2)。

化合物2黄色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z279 [M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.51(3H，s，H-17)，6.72(1H，s，H-10)，6.97(1H，d，J= 8.0 Hz，H-9)，7.26(1H，m，H-7)，7.31～7.29(3H，m，H-12，14，16)，7.40～7.38(2H，m，H-13,15)，7.43(1H，td，J= 7.4，1.5 Hz，H-8)，7.95(1H，d，J= 7.6 Hz，H-6)，8.36(1H，s，H-1)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：37.9(C-17)，120.8(C-9)，125.6(C-7)，127.1(C-5b)，128.8(C-13,15)，129.0(C-12,16)，129.6(C-14)，131.8(C-6)，132.3(C-11)，132.5(C-8)，133.1(C-3)，133.3(C-10)，134.4(C-9b)，166.5(C-5)，167.9(C-2)。以上核磁数据与文献[12]报道的核磁数据基本一致，故确定该化合物为(E)-3-benzylidene-4-methyl-3,4-dihydro-1H-benzo[e][1,4]diazepine-2,5-dione。

化合物3黄色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z279 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.19(3H，s，H-17)，6.94(1H，d，J= 8.0 Hz，H-9)，6.95(1H，s，H-10)，7.29～7.26(1H，m，H-7)，7.40～7.34(5H，m，H-12～16)，7.47(1H，td，J= 7.9，1.5 Hz，H-8)，7.62(1H，s，1-NH)，8.02(1H，dd，J= 7.9，1.4 Hz，H-6)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：36.2(C-17)，120.4(C-9a)，125.5(C-7)，125.8(C-5b)，129.2(C-12，14，16)，129.6(C-13，15)，130.0.(C-11)，131.7(C-6，10)，132.9(C-8)，133.6(C-3)，135.6(C-9b)，166.3(C-5a)，171.2(C-2)。以上核磁数据与文献[12]报道的核磁数据基本一致，故确定该化合物为(Z)-3-benzylidene-4-methyl-3,4-dihydro-1H-benzo[e][1,4]diazepine-2,5-dione。

化合物4无色晶体(MeOH)；ESI-MS：m/z295 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.24(3H，s，H-17)，4.02(1H，s，H-10)，6.65(2H，d，J= 6.3 Hz，H-12，16)，7.09(1H，m，H-14)，7.15(1H，m，H-9)，7.22(2H，d，J= 7.6 Hz，H-13，15)，7.28(1H，m，H-6)，7.39(1H，m，H-8)，7.51(1H，m，H-7)，8.60(1H，s，H-1)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：31.6(C-17)，65.0(C-10)，70.4(C-3)，120.8(C-9a)，125.7(C-7)，126.2(C-13，15)，128.4(C-12，C-16)，129.4(C-14)，130.3(C-11)，131.9(C-8)，132.8(C-6)，134.0(C-9b)，166.0(C-5)，167.5(C-2)。以上核磁数据与文献[13,14]报道的核磁数据基本一致，故确定该化合物为cyclopenin。

化合物5无色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z281 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：2.84(1H，dd，J= 13.6，6.0 Hz，H-10a，A-type)，2.71(1H，m，H-10a，B-type)，3.14(3H，s，H-17，A-type)，2.91(3H，s，H-17，B-type)，3.49(1H，dd，J= 12.0，6.0 Hz，H-10，A-type)，3.21(1H，dd，J= 14.4，6.4 Hz，H-10，B-type)，4.35(1H，t，J= 7.1 Hz，H-3，A-type)，4.26(1H，dd，J= 10.4，6.2 Hz，H-3，B-type)，7.01(2H，m，H-13，15，A-type)，7.01(2H，m，H-13，15，B-type)，7.06(1H，d，J= 8.0 Hz，H-9，A-type)，6.96(1H，d，J= 8.0 Hz，H-9，B-type)，7.25～7.17(3H，m，H-12，14，16，A-type，B-type)，7.30(2H，dd，J= 18.6，4.6 Hz，H-7，A-type，B-type)，7.51(1H，t，J= 7.5 Hz，H-8，A-type)，7.44(1H，t，J= 7.6 Hz，H-8，B-type)，8.10(1H，d，J= 7.7 Hz，H-6，A-type)，7.95(1H，d，J= 7.7 Hz，H-6，B-type)，9.48(1H，s，H-1，A-type)，9.16(1H，s，H-1，B-type)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：34.7(C-10，A-type)，32.3(C-10，B-type)，39.8(C-17，A-type)，29.4(C-17，B-type)，68.6(C-3，A-type)，56.4(C-3，B-type)，120.9(C-9，A-type)，120.3(C-9，B-type)，125.4(C-7，A-type)，125.0(C-7，B-type)，127.4(C-5a，A-type)，127.0(C-5a，B-type)，128.9(C-14，A-type)，128.8(C-14，B-type)，129.0(C-12，16，A-type)，129.0(C-12，16，B-type)，129.1(C-13，15，A-type)，129.1(C-13，15，B-type)，131.9(C-6，A-type)，131.5(C-6，B-type)，132.8(C-8，A-type)，132.5(C-8，B-type)，135.7(C-9a，A-type)，134.8(C-9a，B-type)，136.5(C-11，A-type)，135.7(C-11，B-type)，168.6(C-5，A-type)，166.1(C-5，B-type)，171.8(C-2，A-type)，170.3(C-2，B-type)。该化合物由于N-4的构型(孤对电子)上下翻转，导致七元环出现构象不同的异构体，对比核磁数据与文献[14]报道的核磁数据基本一致，故确定该化合物为(3S)-1,4-benzodiazepine-2,5-diones。

化合物6无色针晶(MeOH)；ESI-MS：m/z480 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.01(3H，s，12c-CH3)，1.26(3H，s，H-2′)，1.29(3H，s，H-3′)，1.32(3H，s，12b-CH3)，1.43(1H，dd，J= 12.4，3.9 Hz，H-13b)，1.62～1.56(1H，m，H-5b)，1.76～1.71(1H，m，H-6b)，1.96～1.90(1H，m，H-14b)，2.05～2.01(2H，m，H-5a，6a)，2.08(3H，s，3-COOCH3)，2.30～2.22(1H，m，H-14a)，2.44(1H，dd，J= 13.0，11.0 Hz，H-7b)，2.71(1H，d，J= 5.9 Hz，H-7a)，2.74(1H，d，J= 6.1 Hz，H-6a)，2.88～2.79(1H，m，H-13a)，3.34(2H，m，H-2，1′)，4.68～4.61(1H，m，H-14a)，5.24(1H，dt，J= 5.8，1.8 Hz，H-3)，5.75(1H，dd，J= 5.8，1.4 Hz，H-4)，7.07(2H，dd，J= 5.7，2.6 Hz，H-9，10)，7.32～7.28(1H，m，H-11)，7.32～7.28(1H，m，H-11)，7.45～7.42(1H，m，H-8)，7.78(1H，s，H-12)；13C NMR(400 MHz，CDCl3)δ：16.4(12b-CH3)，20.1(12c-CH3)，21.0(C-6)，21.5(COOCH3)，26.1(C-2′)，26.5(C-3′)，27.5(C-7)，28.3(C-13)，28.4(C-14)，34.8(C-5)，43.1(C-12c)，49.8(C-6a)，50.9(C-12b)，65.6(C-3)，71.8(C-1′)，74.1(C-14a)，77.9(C-4b)，81.2(C-2)，111.6(C-11)，114.8(C-4)，117.5(C-7a)，118.6(C-8)，119.6(C-9)，120.6(C-10)，125.3(C-7b)，139.8(C-11a)，150.4(C-4a)，152.4(C-12a)，170.9(3-COOCH3)。以上核磁数据与文献[15]报道的核磁数据基本一致，故确定该化合物为O-acetyl-β-paxitriol。

化合物7黄色油状(CHCl3)；ESI-MS：m/z388 [M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.04(3H，s，H-21)，1.16(3H，s，H-22)，2.48(1H，t，J= 11.9 Hz，H-11)，2.61(1H，dd，J= 12.4，6.0 Hz，H-11)，4.07(1H，dd，J= 11.3，5.9 Hz，H-11a)，5.10(1H，s，H-6)，5.10(1H，d，J= 9.7 Hz，H-20)，5.15(1H，d，J= 10.5 Hz，H-20)，5.65(1H，s，H-5a)，5.99(1H，dd，J= 17.3，10.8 Hz，H-19)，6.33(1H，s，H-12)，6.61(1H，J= 7.8 Hz，H-7)，6.78(1H，t，J= 7.3 Hz，H-8)，7.11(1H，t，J= 7.6 Hz，H-8)，7.19(1H，d，J= 7.5 Hz，H-10)，7.30(1H，s，H-15)，7.74(1H，s，H-17)，9.25(1H，s，H-2)，9.25(1H，s，H-16)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：22.6(C-21)，23.0(C-22)，36.9(C-11)，41.0(C-18)，59.0(C-11a)，61.7(C-10b)，78.6(C-5a)，109.2(C-12)，111.3(C-7)，114.7(C-20)，119.3(C-9)，122.0(C-3)，125.3(C-10)，125.6(C-13)，128.7(C-10a)，129.3(C-8)，134.9(C-17)，136.8(C-15)，143.5(C-19)，150.0(C-6a)，159.5(C-4)，167.0(C-1)。以上核磁数据与文献[16]报道的核磁数据基本一致，故鉴定此化合物为roquefortine C。

化合物8黄色油状(CHCl3)；ESI-MS：m/z388 [M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.04(3H，s，H-21)，1.15(3H，s，H-22)，2.48(1H，t，J= 11.9 Hz，H-11)，2.61(1H，dd，J= 12.2，5.8 Hz，H-11)，4.12(1H，dd，J= 11.5，5.8 Hz，H-11a)，4.95(1H，s，H-6)，5.09(1H，d，J= 17.0 Hz，H-20)，5.13(1H，d，J= 9.7 Hz，H-20)，5.66(1H，s，H-5a)，5.99(1H，dd，J= 17.3，10.8 Hz，H-19)，6.58(1H，d，J= 7.8 Hz，H-7)，6.71(1H，s，H-12)，6.74(1H，dd，J= 13.2，5.9 Hz，H-8)，7.09(1H，t，J= 7.6 Hz，H-9)，7.16(1H，d，J= 7.5 Hz，H-10)，7.18(1H，s，H-17)，7.68(1H，s，H-15)，9.69(1H，s，H-16)，11.61(1H，s，H-2)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：22.6(C-21)，23.1(C-22)，37.4(C-11)，41.1(C-18)，59.3(C-11a)，61.8(C-10b)，78.2(C-5a)，105.0(C-12)，109.1(C-7)，114.7(C-20)，117.2(C-17)，119.0(C-9)，125.4(C-10)，126.9(C-3)，129.0(C-10a)，129.1(C-8)，135.2(C-15)，137.7(C-13)，143.7(C-19)，150.5(C-6a)，158.6(C-4)，165.6(C-1)。以上核磁数据与文献[17]报道的核磁数据基本一致，故鉴定此化合物为isoroquefortine C。

化合物9白色粉末(MeOH)；ESI-MSm/z：278 [M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：4.59(1H，s，H-3)，6.96(1H，d，J= 7.9 Hz，H-9)，7.11(1H，t，J= 7.5 Hz，H-7)，7.22(3H，d，J= 6.5 Hz，H-13，14，15)，7.32～7.27(1H，m，H-8)，7.35(2H，d，J= 7.6 Hz，H-12，16)，7.56(1H，d，J= 7.7 Hz，H-6)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：76.6(C-3)，78.3(C-4)，116.9(C-9)，124.9(C-7)，127.6(C-6)，128.6(C-13，14，15)，128.7(C-12，16)，130.1(C-8)，132.4(C-5)，136.6(C-10)，141.4(C-11)，172.6(C-2)。以上核磁数据与文献[18]报道的核磁数据基本一致，故确定该化合物为aflaquinolone G。

化合物10白色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z260 [M+Na]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.07(2H，dt，J= 14.9，7.8 Hz，H-6，7)，7.34(4H，m，H-8，9，12，16)，7.44(1H，t，J= 7.5 Hz，H-14)，7.51(2H，t，J= 7.5 Hz，H-13，15)，9.21(1H，s，3-OH)，12.23(1H，s，1-NH)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：115.2(C-9)，120.9(C-5)，122.1(C-7)，123.9(C-4)，124.3(C-6)，126.4(C-8)，127.6(C-14)，128.3(C-13，C-15)，129.8(C-12，C-16)，133.2(C-3)，133.7(C-11)，142.4(C-10)，158.3(C-2)。以上核磁数据与文献[19]报道的核磁数据基本一致，故鉴定此化合物为3-hydroxy-4-phenylquinolin-2(1H)-one。

化合物11白色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z254 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.72(1H，d，J= 5.1 Hz，H-16)，6.73(1H，d，J= 4.8 Hz，H-15)，6.83(1H，dd，J= 5.1，4.2 Hz，H-14)，7.09～7.05(1H，m，H-6)，7.11(1H，d，J= 7.8 Hz，H-7)，7.29(1H，s，H-12)，7.32(1H，m，H-5)，7.34(1H，d，J= 7.1 Hz，H-8)，9.12(1H，s，13-OH)，9.51(1H，s，1-NH)，12.19(1H，s，3-OH)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：114.6(C-14)，115.2(C-8)，116.7(C-16)，120.4(C-15)，120.9(C-10)，122.1(C-6)，124.1(C-11)，124.5(C-7)，126.4(C-5)，129.4(C-12)，133.1(C-9)，134.9(C-4)，142.2(C-3)，157.3(C-13)，158.3(C-2)。以上核磁数据与文献[20]报道的核磁数据基本一致，故鉴定此化合物为viridicatol。

化合物12白色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z299 [M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：1.44(1H，ddd，J= 12.9，11.8，4.7 Hz，H-5b)，2.12(1H，dd，J= 13.0，5.8 Hz，H-5a)，3.12(1H，d，J= 5.0 Hz，H-10)，3.78(2H，m，H-3)，4.34(1H，t，J= 4.7 Hz，H-6)，4.41(1H，ddd，J= 11.7，5.9，1.8 Hz，H-9)，4.47～4.44(1H，m，H-4)，6.78～6.74(2H，m，H-12，16)，7.12～7.08(2H，m，H-12，15)；13C NMR(400 MHz，CD3OD)δ：37.5(C-10)，38.9(C-5)，55.3(C-3)，57.8(C-9)，58.3(C-6)，68.5(C-4)，116.2(C-13,15)，127.7(C-11)，132.1(C-12,16)，157.7(C-14)，167.1(C-7)，171.1(C-1)。以上核磁数据与文献[21]报道核磁数据基本一致，故确定该化合物为环(络氨酸-脯氨酸)。

化合物13黄色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z152 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.63(2H，s，H-7)，7.34～7.25(5H，m，H-2～6)，8.31(1H，br s，-NH)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：41.3(C-7)，127.5(C-4)，128.8(C-3，5)，129.5(C-2，6)，133.5(C-1)，178.0(C-8)。以上核磁数据与文献[22]报道的核磁数据基本一致，故确定该化合物为N-苯甲基氨基甲酸。

化合物14无色油状(MeOH)；ESI-MS：m/z290 [M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：3.81(1H，dd，J= 12.5，2.7 Hz，H-9b)，3.95(1H，dd，J= 12.5，2.5 Hz，H-9a)，4.23(1H，m，H-8)，4.39(1H，dd，J= 5.1，2.6 Hz，H-7)，4.82～4.77(1H，m，H-6)，6.03(1H，d，J= 6.4 Hz，H-5)，8.24(1H，s，H-1)，8.36(1H，s，H-4)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：63.5(C-9)，72.7(C-7)，75.5(C-6)，88.2(C-8)，91.3(C-5)，142.0(C-4)，150.1(C-3)，153.5(C-1)，157.6(C-2)。以上核磁数据与文献[23]报道的核磁数据基本一致，故鉴定此化合物为(5S,6R,7S,8R)-5-amino-(2Z,4Z)-1,2,3-trihydroxybuta-2,4-dienyloxy-pentane-6,7,8,9-tetraol。

化合物15无色针晶(MeOH)；ESI-MS：m/z181 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：2.11(3H，s，3′-CH3)，2.22(3H，s，5′-CH3)，2.56(3H，s，H-1)，7.48(1H，s，H-6′)，12.88(1H，s，2′-OH)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：7.9(3′-CH3)，16.3(5′-CH3)，26.2(C-1)，111.8(C-1′)，113.8(C-3′)，117.2(C-5′)，131.2(C-6′)，162.0(C-2′)，162.3(C-4′)，204.4(C-2)。以上核磁数据与文献[24]报道的核磁数据基本一致，故鉴定此化合物为2′，4′-二羟基-3′，5′-二甲基苯乙酮。

化合物16黄色油状物(MeOH)；ESI-MS：m/z288 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：0.96(3H，s，H-19)，1.05(3H，s，H-20)，1.16～1.19(1H，m，H-7b)，1.18(3H，s，H-17)，1.20(3H，d，J= 7.2 Hz，H-16)，1.28(3H，s，H-18)，1.39(1H，d，J= 5.3 Hz，H-15)，1.52～1.47(1H，m，H-13b)，1.59～1.54(1H，m，H-13a)，1.60～1.54(1H，m，H-7a)，1.66～1.62(2H，m，H-10b，12b)，1.69～1.66(2H，m，H-8b，12a)，1.98(1H，d，J= 14.6 Hz，H-10a)，2.09(1H，dd，J= 11.5，5.9 Hz，H-8)，2.71～2.64(1H，m，H-4)，2.25(1H，dd，J= 9.3，5.3 Hz，H-6)，5.97(1H，d，J= 10.0 Hz，H-2)，6.94(1H，dd，J= 10.0，5.9 Hz，H-3)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：18.9(C-16)，21.1(C-17)，27.3(C-19)，32.7(C-18)，34.5(C-7)，37.7(C-4)，39.0(C-12)，39.2(C-8)，40.9(C-13)，42.9(C-14)，48.1(C-10)，52.4(C-11)，56.2(C-6)，57.6(C-9)，59.1(C-5)，73.8(C-15)，127.6(C-2)，154.6(C-3)，206.2(C-1)。以上核磁数据与文献[25]报道的核磁数据基本一致，故鉴定此化合物为conidiogenone B。

图2 化合物1～16的化学结构Fig.2 Chemical structure of compounds 1-16

3.2 抑菌测试结果

抑菌测试结果显示，从虫草内生菌分离得到的化合物1～16对测试的菌株均无明显抑制圈，没有明显的活性。

4 讨论

本文从冬虫夏草内生菌P.crustosum的大米固体发酵物中分离得到了16个化合物，主要为苯二氮卓类、吲哚二萜类和喹诺酮类生物碱，其中化合物1和2是新的天然产物，化合物1～4、6、9、12～14和16为首次从该真菌中分离得到。与课题组前期得到的结果类似[26]。已有报道表明生物碱类具有广泛药理活性，如抗肿瘤、消炎镇痛等，本文对分离得到的化合物进行了初步的抑菌测试但均没有明显的抑制活性，推测是试验菌株的选择类型较少或者是该类化合物具有其他的生物活性。文献表明化合物4对流感神经氨酸酶有很强的抑制作用，IC50值为5.02 μM[27]；化合物7对Balanusamphitrite、Bugulaneritina有抑制作用，具防污抗菌活性，EC50分别为6.2、2.1 μg/mL[28]。这提示我们可以从其他角度来探讨此类化合物的生物活性，为后续实验的开展提供参考。

Penicilliumcrustosum的液体培养和大米固体培养的代谢产物类型差异较大，液体培养产物中含有较多硫代二酮哌嗪类的化合物，研究报道这些化合物因为二硫键的存在而具有较强的毒性，而大米固体发酵物中的生物碱都不具有硫原子，可能是因为培养基中没有加入相关的元素。因此在进行中药内生菌的次生代谢产物研究时，可以通过改变培养方式从而得到结构新颖的生物活性化合物。