□ 宋海珍 魏万彩 马 庆 祁叠鸣 石红霞 兰州中检科测试技术有限公司

沙门氏菌为革兰氏阴性杆菌，属于肠杆菌科，无荚膜和芽孢。其在自然界有广泛的宿主，主要在动物及人体肠道生长繁殖[1]。近年来，因食品污染沙门氏菌而发生的食源性疾病或食品安全事件屡见不鲜[2]，已引起社会的广泛关注，因此，在食品微生物检测中，沙门氏菌的检验必须加以高度重视。

能力验证能否通过是评价实验室检验水平的重要依据，因此兰州中检科测试技术有限公司微生物检测部参加外部能力验证或实验室间比对以验证实验室能力，保证实验结果的准确性和可靠性，以提高检测机构竞 争力[3]。

1 材料与方法

1.1 样品

实验室共收到中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的检测能力验证计划的2份乳粉样品，样品编号分别是20-J 793和20-K 562，每份样品均为白色冻干块状，西林瓶真空包装。

1.2 培养基与试剂

缓冲蛋白胨水BPW；四硫磺酸钠煌绿增菌液；亚硒酸盐胱氨酸增菌液；亚硫酸铋琼脂；沙门氏菌属显色培养基；营养琼脂；沙门氏菌干制生化鉴定试剂盒，北京陆桥技术有限责任公司；沙门氏菌属诊断血清，宁波天润生物药业有限公司；沙门氏菌阳性菌株鼠伤寒沙门氏菌（CICC 21484）中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.3 仪器

电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；立式自动压力蒸汽灭菌锅，厦门致微仪器有限公司；恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；生物安全柜，Nuaire；胃氏均质仪；BagMixer，interscience；电子天平，江苏常熟市双杰测试仪器厂；一次性无菌培养皿；无菌称样袋；黄口试剂瓶；锥形瓶；试管；移液管等。

1.4 方法

参照能力验证作业指导书和《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4-2016）[4]进行实验。所有步骤均为无菌操作。

1.4.1 样品前处理

从冰箱中取出样品放进生物安全柜，待其温度恢复室温后将样品的西林瓶打开。样品需要用60 mL稀释液再水化。具体操作步骤为：样品开启后，立即加入5 mL缓冲蛋白胨水（BPW）进行再水化，待溶解后，吸出放入无菌瓶中，再用余下的稀释液清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述无菌瓶中，此溶液是待测样品原液，等同于60 mL的乳品样品。

1.4.2 预增菌

吸取待测样品原液25 mL于无菌均质袋内，再称取225 mL缓冲蛋白胨水，用胃氏均质器拍打2 min。将编号2份增菌液、阳性对照和空白对照放置于电热培养箱，36 ℃培养18 h。

1.4.3 增菌

轻轻晃匀预增菌培养物，各移取1 mL，分别转种于10 mLTTB 和 10 mLSC，前者于42 ℃恒温水浴锅培养24 h，后者于36 ℃培养箱培养24 h。

1.4.4 分离

用10 μL一次性接种环取增菌液，分别划线于BS琼脂平板和沙门氏菌属显色培养基平板进行分离，于36 ℃分别培养48 h（BS琼脂平板）和24 h （沙门氏菌属显色培养基平板）。

1.4.5 生化鉴定实验

从2个样品的选择性培养基平板上分别挑取典型菌落3个，接种TSI，先在斜面划线，再进行底层穿刺，同时直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36 ℃培养24 h。将营养琼脂平板上纯化后的菌落用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒进行鉴定。

1.4.6 血清学鉴定

1.4.6.1 检查培养物有无自凝性

取一片洁净的载玻片，先在上面滴加一滴生理盐水，再刮取待测菌混匀，30～60 s后在黑色背景下晃动载玻片并观察反应，如果出现菌体凝集成块或肉眼可见的颗粒，即认为有自凝性，反之无自凝性。对未出现自凝性的细菌培养物按照下面方法进行血清学鉴定。

1.4.6.2 多价菌体抗原O鉴定

在玻片上划出2个约1 cm×2 cm 的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体O抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将2个区域内的菌苔研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。

1.4.6.3 多价鞭毛抗原H鉴定

操作同1.4.6.2。

2 结果与分析

2.1 选择性分离结果

观察各个平板上生长的菌落,菌落特征见表1。从表1的描述可推断2份样品均可能检出沙门氏菌。

表1 选择性培养基上的菌落特征

2.2 生化鉴定结果

将2份样品在BS琼脂平板和沙门氏菌属显色培养基平板的所有菌落形态在营养琼脂平板上纯化，然后使用生化鉴定试剂盒进行鉴定,生化项目包括三糖铁、赖氨酸脱羧酶、氰化钾、靛基质、尿素、甘露醇、山梨醇、ONPG，结果均与沙门氏菌属生化特性一致，详细结果见表2。

表2 不同菌落形态的生化反应结果

2.3 血清分型结果

按照GB 4789.4-2016对2个样品进行血清学鉴定，发现A～F多价O血清、H多价2、H多价4均凝集，故进一步开展血清分型，结果见 表3。

表3 血清分型结果

3 结论

此次实验中选择性琼脂培养基直接采用了BS琼脂平板和沙门氏菌属显色培养基平板，后者相比木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂和HE琼脂，对沙门氏菌属有更高的特异性，可以排除大肠菌群及其他杂菌的干扰。

多价鞭毛抗原（H）鉴定时，直接从培养基上刮取待测菌混匀于诊断血清中，凝集效果不好。参照国家标准，发现可能是因为H抗原发育不良的缘故，经过多次试验，将菌株接种在0.6%半固体琼脂平板的中央，待菌落蔓延生长时,在其边缘部分刮取待测菌混匀于诊断血清中，几分钟后就出现了细菌凝集成块或肉眼可见的颗粒，凝集效果有了明显提高，后期再做血清学鉴定时可采用此方法。

能力验证是检验实验室人员是否具备检测某个项目的技术能力，是提高实验室整体检测水平的重要途径[5]。本实验室此次能力验证结果与考核方一致，结果为满意。