□ 张黎梅 许 秦 郑世妍 汪云飞 昆明市食品药品检验所

蜂蜜是一种高营养价值的食品，深受人们的喜爱，因此蜂蜜中有害物质的残留给人体健康带来的危害也引起了人们广泛的关注。蜂蜜中残留的甲硝唑和地美硝唑等硝基咪唑类药物严重危害着人们的健康。硝基咪唑类药物具有抗原虫和抗厌氧菌活性，主要用于预防和治疗畜禽组织滴虫病和猪密螺旋体性痢疾、阿米巴原虫以及厌氧菌感染等疾病[1]。长期摄入硝基咪唑类药物具有致突变性和潜在的致癌性，如果在动物中使用会对动物源性食品安全构成威胁。被欧盟，美国、加拿大等多个国家列为违禁药物[2]，食品安全国家标准 GB 31650-2019[3]规定，地美硝唑和甲硝唑允许作治疗用，但不得在食品中检出兽药。

我国标准GB/T 23410-2009[4]提出了液相色谱-质谱/质谱法测定蜂蜜中硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定，但在研究中发现使用该方法测定，甲硝唑和地美硝唑的回收率不高，本文在国家标准基础上进一步选择优化前处理等步骤，建立了同时检测蜂蜜中甲硝唑和地美硝唑的含量方法。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

1.1.1 实验仪器

LCMS-8045型高效液相色谱-三重四级杆质谱联用仪（日本岛津公司）、超纯水仪（sartorius公司）、旋转蒸发仪（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）、CP224C型分析天平（奥豪斯仪器（上海）有限公司）

1.1.2 试剂

乙酸乙酯、甲醇、乙酸铵均为色谱纯（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；甲硝唑（0.25 g，德国Dr公司）；地美硝唑（0.25 g，德国Dr公司）

1.2 实验内容及方法

1.2.1 甲硝唑、地美硝唑标准工作溶液配制

准确称取0.011 42 g甲硝唑标准品、0.010 18 g地美硝唑标准品分别置于100 mL容量瓶中，用甲醇定容得 到114.2 μg/mL、101.8 μg/mL的标准储备溶液。分别准确吸取标准溶 液0.01 mL、0.05 mL、0.1 mL、 0.2 mL、0.5 mL和1.0 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇-水定容至刻度。

1.2.2 样品提取

准确称取混合均匀的样品10.00 g（精确到0.01 g）试样，放置于50 mL具塞离心管中，加入10 mL饱和氯化钠水溶液，涡旋混匀。后加入15 mL 乙酸乙酯涡旋5 min，超声提取 10 min。再以3 500 r/min离心 5 min，取上层乙酸乙酯到50 mL鸡心瓶中，再加入10 mL乙酸乙酯，重复上述提取步骤，合并提取液，40 ℃水浴旋至近干，加入5 mL甲醇溶解残渣，然后过经甲醇预淋洗的SPE柱净化，加入10 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，40 ℃水浴旋至近干，甲醇-水溶解定容至1 mL，待测。

1.2.3 仪器条件

液相色谱条件：液相色谱-质谱仪(串联四级杆)：配有电喷雾离子源；色谱柱：C18柱，100 mm×3.0 mm， 粒径1.7 μm；流动相：A相为 10 mmol/L的乙酸铵溶液，B相为甲醇溶液；梯度洗脱，流速：0.3 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：2 μL。

质谱条件：离子源：电喷雾离子源（Electrospray ionization，ESI源）；检测方式：多反应监测（MRM）；扫描方式：采用正离子模式扫描。质谱条件如表1所示。

表1 甲硝唑和地美硝唑质谱参数

2 结果与分析

2.1 标准图谱

通过不同的比例梯度程序来考察两组分的出峰、峰形、色谱分离情况，最终选择1.2.3的色谱条件，分离效果见图1。

图1 甲硝唑和地美硝唑多反应监测色谱图

2.2 线性关系

对浓度范围为1～100 ng/mL标准序列工作液按选定的色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标做线性回归方程。由表2可知，甲硝唑和地美硝唑在1～100 ng/mL范围内线性良好，相关系数r2均在0.999以上。

表2 甲硝唑和地美硝唑的回归方程和相关系数

2.3 回收率、精密度和检测限

称取蜂蜜样品10.00 g（精确至 0.01 g），加入甲硝唑（114.2 μg/mL）、地美硝唑（101.8μg/mL）标准储备液20 μL、30 μL、80 μL。按 照 上文所述提取方法处理样品，上机检测，根据测定浓度与加入量之间的差异来计算其回收率，回收率在78.57%～116.02%。甲硝唑和地美硝唑的相对标准偏差RSD值分别为：3.406%、4.081%，检测限分别为 0.27 μg/kg和0.38 μg/kg。详见表3

表3 甲硝唑和地美硝唑的回收率、精密度和检测限

2.4 样品的测定

实验通对市场购买的4种蜂蜜（大姚野坝子蜂蜜，冠生园蜂蜜，老山蜂蜜，洋槐蜂蜜）进行实验，均未检出甲硝唑和地美硝唑。

3 结果分析

3.1 提取液的选择

因硝基咪唑类药物具有酸、碱两性，在弱碱性条件下以分子状态游离，所以，一般常用于硝基咪唑类药物的提取剂主要有二氯甲烷、乙腈、甲醇和乙酸乙酯。由于二氯甲烷毒性较大，为尽可能的保证实验安全，选择使用乙酸乙酯为本实验的提取剂，实验结果得出乙酸乙酯提取各样品分离效果较为理想且回收率也较高。

3.2 前处理方法的优化

蜂蜜种类繁多，粘度差异较大，对于无结晶的样品，搅拌均匀取样，对于有结晶的固态样品，应在低于 60 ℃水浴中加热，不断搅拌，样品均匀后再取样。以保证样品均匀性，减小平行测定结果的误差。

4 结论

本文建立了高效液相色谱-串联质谱测定甲硝唑和地美硝唑的方法。实验结果表明：甲硝唑与地美硝唑在1～100 ng/mL的范围内线性关系良好，相关系数均为r2=0.999。回收率为78.57%～116.02%，相对标准偏差为3.406%～4.081%，检出限（S/N=3）为0.27 μg/kg、0.38 μg/kg，结果较为理想。本实验前处理较为简单，回收率，精密度，检出限较好，能够快速，准确地测定蜂蜜中的甲硝唑与地美硝唑含量。