胡 淼， 童旭辉， 黄 杰， 陈 蕾， 门运政， 田成鸿， 董淑英，2△

蚌埠医学院 1药学院药理学教研室 2心脑血管疾病基础与临床重点实验室，蚌埠 233030

脑卒中在我国是一种常见的神经系统损伤性疾病，是导致患者终生残疾和死亡的重要原因之一[1-2]。由脑动脉血栓形成引起的缺血性脑卒中占脑卒中的80%以上[3-4]。临床上多采用静脉溶栓的方式治疗缺血性脑卒中，然而，溶栓后又会引起脑缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)损伤[5]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一种异源三聚体复合物，由α-催化亚基、β-调节亚基以及γ-调节亚基组成。AMPK是机体内的能量传感器，可以增强能量利用，调节自噬和线粒体的融合与裂变，参与了多种病理生理活动[6-7]。近年来研究表明，激活AMPK可以通过调节能量代谢、氧化应激、线粒体功能从而减轻脑I/R损伤[8-9]。

铁死亡是一种由铁离子依赖的脂质过氧化驱动引起的非凋亡细胞死亡形式。研究表明，铁死亡参与了I/R损伤、神经退行性疾病以及癌症的发生[10-13]。Tuo等[14]在小鼠脑缺血损伤中检测到显著的铁死亡发生，而再灌注时施用铁死亡抑制剂liproxstatin-1或ferrostatin-1可显著缩小梗死面积，从而减轻脑I/R损伤。最近有文献报道，在肿瘤细胞中使用AMPK激活剂能够调节细胞的脂质合成代谢，进而减轻细胞铁死亡的发生[15]。此外，有文献表明上调p-AMPK的表达能够降低大鼠脑I/R后的脂质过氧化物水平及随后的神经损伤[16]。然而，在脑I/R中，激活AMPK的效应是否与铁死亡有关尚未见研究报道。为了进一步阐明激活AMPK在抗脑I/R损伤中的作用机制，本实验使用小鼠大脑中动脉栓塞模型(middle cerebral artery occlusion，MCAO)探讨铁死亡在AMPK激活产生的抗小鼠脑I/R损伤中的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

本实验中所用到的SPF级雄性ICR小鼠均购自安徽医科大学实验动物中心。小鼠体重26～33 g，8～13周龄。饲养于温湿度适宜的动物房中，可自由饮水摄食。

1.2 主要试剂

AMPK激动剂AICAR(美国MCE公司)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，Sigma公司)；AMPK、p-AMPK、TFR1、SLC7A11、GPX4抗体(CST公司)、GAPDH抗体(Abcam公司)；丙二醛(MDA)试剂盒、组织铁试剂盒(南京建成公司)。

1.3 实验分组

将雄性ICR小鼠随机分为3组：Sham组；脑I/R组；IR+AICAR组(脑I/R+AMPK激活剂AICAR)，每组10只。AICAR溶于生理盐水，于缺血前30 min腹腔注射(500 mg/kg)给药。

1.4 MCAO模型的制备

腹腔注射水合氯醛(0.04 mL/10 g)麻醉小鼠。将小鼠固定在手术台上，剃除颈部毛发，碘伏和75%乙醇消毒。在小鼠颈部正中处切开2 cm左右小口，分离小鼠右侧的颈内动脉、颈外动脉和颈总动脉。用手术缝合线结扎小鼠右侧颈总动脉，使用动脉钳在颈总动脉近心端阻断血流，然后在颈外动脉处切一小口，将制作好的线栓缓慢从小口处插入颈内动脉，至有明显阻力为止。线栓经颈内动脉插入到大脑中动脉造成大脑的局灶性缺血。1 h后将线栓拔出，缝合伤口，正常饲养，再灌注24 h后进行其他实验处理。Sham组进行同样操作，但线栓插入的深度未至大脑中动脉。

1.5 神经行为学评价

参考Longa 5分法对脑缺血1 h再灌注24 h后的小鼠进行神经行为学评价。0分为正常行走活动，无神经功能缺失者；1分为手术对侧的前肢内收，无力者；2分为行走时向手术对侧转圈或轻度倾倒者；3分为小鼠有严重行走障碍或重度倾倒者；4分为不能行走或昏迷者。评分1～4分为模型复制成功。

1.6 脑梗死体积的测定

小鼠脑梗死体积采用TTC染色法测定。小鼠缺血1 h再灌注24 h后快速断头取脑，将大脑置于-20℃冰箱内12 min后取出，随即切成厚度约为2 mm的4片脑片，置于1%的TTC染色液中，于37 ℃水浴锅中孵育20 min。染色后以4%的多聚甲醛固定，扫描并计算小鼠脑梗死体积百分比。

1.7 线粒体形态的观察

采用透射电子显微镜观察脑组织中线粒体的形态变化。小鼠缺血1 h再灌注24 h后快速断头取脑，取半暗带脑组织切成1 mm3组织块，使用戊二醛固定，再用PBS清洗，清洗后再将组织块固定于1%锇酸中。固定完成后使用乙醇脱水并将组织块包埋于环氧树脂中，然后烘干、切片、染色。最后在透射电子显微镜下观察线粒体的形态。

1.8 MDA及Fe2+水平的测定

小鼠缺血1 h再灌注24 h后快速断头取脑，准确称取脑组织重量，用生理盐水制成10%的匀浆，离心后取上清待测。采用MDA试剂盒及组织铁试剂盒检测小鼠脑组织中MDA和Fe2+水平。

1.9 免疫印迹法检测AMPK、p-AMPK、TFR1、SLC7A11和GPX4蛋白的表达

小鼠再灌注24 h后，快速断头取脑。取小鼠右侧大脑半暗带皮层区域脑组织用于免疫印迹检测。将提取的脑组织样品置于冰上，随后加入裂解液制成组织匀浆，提取蛋白。经12% SDS-PAGE凝胶电泳后，转膜、封闭后放置于AMPK(1∶1000)、p-AMPK(1∶1000)、TFR1(1∶2000)、SLC7A11(1∶2000)、GPX4(1∶2000)、GAPDH(1∶2000)抗体中4 ℃孵育过夜。随后在二抗中4 ℃孵育2 h，最后与显影液充分接触后采集发光图像，用Evolution-Capt Edge对条带进行扫描分析。

1.10 统计学分析

2 结果

2.1 激活AMPK对脑I/R小鼠神经行为学评分的影响

小鼠缺血1 h再灌注24 h后，采用Longa 5分法检测各组小鼠神经行为学评分。实验结果表明(表1)，Sham组小鼠神经行为学评分为0，无神经功能障碍；I/R组神经行为学评分为(3.20±0.63)显著高于Sham组(P<0.01)，有明显的神经功能障碍；而使用AICAR预处理组小鼠神经行为学评分为(1.90±0.88)明显低于I/R组(P<0.05)，神经功能障碍有显著缓解。上述结果表明，激活AMPK能够显著减轻小鼠脑I/R损伤带来的神经功能障碍。

表1 AICAR对脑I/R小鼠神经功能的影响(例)

2.2 激活AMPK对I/R小鼠脑组织梗死体积的影响

小鼠缺血1 h再灌注24 h后，采用TTC染色法对不同组别小鼠脑组织进行染色。大脑梗死区域显示为白色，非梗死区域显示为红色。结果如图1所示，Sham组小鼠无梗死区域；I/R组小鼠梗死区域较Sham组有显著增加(P<0.01)；而I/R+AICAR组较I/R组小鼠脑梗死区域显著减小(P<0.01)。上述结果提示，激活AMPK可以显著减少I/R小鼠脑组织梗死体积，减轻脑I/R损伤。

**P<0.01

2.3 激活AMPK对I/R小鼠脑组织线粒体形态的影响

通过透射电子显微镜观察小鼠脑组织中线粒体的形态变化。结果如图2所示，Sham组小鼠脑组织中线粒体形态完整，结构正常；与Sham组比较，I/R组小鼠脑组织中线粒体形态损伤严重，结构萎缩，膜密度增加，线粒体嵴明显减少或消失，有典型的铁死亡特征表现；而使用AICAR预处理后，线粒体结构明显改善，形态趋于正常，膜密度减小，线粒体嵴数目明显增加。这表明激活AMPK能减轻小鼠脑组织中线粒体的损伤。

A：Sham组；B：I/R组；C：I/R+AICAR组

2.4 激活AMPK对I/R小鼠脑组织Fe2+和MDA水平的影响

小鼠脑组织中Fe2+和MDA水平的变化如图3所示，I/R组较Sham组小鼠Fe2+和MDA水平显著增高(均P<0.01)；而使用AICAR预处理后，Fe2+和MDA水平较I/R组均显著下降(P<0.01，P<0.05)。这表明，激活AMPK减轻脑I/R损伤可能与其降低脑组织中的Fe2+和MDA水平有关。

*P<0.05 **P<0.01

2.5 激活AMPK对I/R小鼠脑组织中p-AMPK/AMPK的影响

p-AMPK和AMPK的表达变化如图4所示，与Sham组相比，小鼠脑I/R后p-AMPK/AMPK显著降低(P<0.01)；而使用AICAR预处理后，p-AMPK/AMPK较I/R组显著增高(P<0.01)。这表明，激活AMPK减轻脑I/R损伤可能与其提高脑组织中的p-AMPK的表达有关。

**P<0.01

2.6 激活AMPK对I/R小鼠脑组织中铁死亡相关蛋白表达的影响

铁死亡相关蛋白TFR1、SLC7A11、GPX4的表达变化如图5所示，与Sham组比较，I/R组的TFR1的表达显著升高(P<0.01)，SLC7A11和GPX4的表达显著降低(均P<0.01)；而使用AICAR预处理后，TFR1的表达显著降低(P<0.01)，SLC7A11和GPX4的表达显著增高(P<0.05，P<0.01)。这表明激活AMPK减轻脑I/R损伤可能与其调节脑组织中铁死亡相关蛋白的表达有关。

*P<0.05 **P<0.01

3 讨论

脑卒中可导致偏瘫、学习记忆障碍等神经损伤症状，由缺血性脑卒中引起的脑I/R损伤给患者及其家庭带来了极其严重的负担。脑I/R损伤的关键机制包括神经细胞的凋亡、铁死亡、Ca2+超载、氧化损伤和炎症等[17]。然而，目前针对脑I/R损伤的药物治疗效果并不理想。因此，探明脑I/R损伤的发生机制和寻找减轻脑I/R损伤的药理靶点，具有非常重要的意义。

AMPK是重要的能量调节因子，在低能量条件下AMPK磷酸化特定的酶和生长控制节点，增强ATP的利用效率，维持机体的能量供给[18]。有研究表明，田蓟苷预处理可激活AMPK-PGC-1α-SIRT3通路进而减轻大鼠的心肌I/R损伤[19]。在肝脏I/R损伤的大鼠中，AMPK和AKT/mTOR信号通路的激活能显著减轻大鼠的肝损伤[20]。本研究使用AMPK受体激活剂AICAR通过MCAO模型来探讨激活AMPK对小鼠脑I/R损伤的保护作用及其机制。研究显示，I/R组小鼠的神经行为学评分及脑梗死体积百分比均较Sham组有显著升高，这表明小鼠MCAO模型构建成功。AICAR预处理后，小鼠的神经行为学评分和脑梗死体积均较I/R组有显著性降低。上述结果表明，激活AMPK能够显著减轻小鼠的脑I/R损伤。

铁死亡是近年来发现的一种新的细胞调控死亡的方式，其特征是铁离子依赖的脂质过氧化物过度累积导致的细胞死亡[21]。铁死亡典型的形态学特征为：细胞膜皱缩、线粒体膜密度增加，线粒体嵴减少或消失等[22]。我们的研究结果显示，I/R组较Sham组线粒体形态皱缩明显，线粒体嵴减少或消失。这表明在脑I/R损伤中有典型的铁死亡特征表现；而使用AICAR预处理后，线粒体形态皱缩情况缓解，线粒体嵴增多，神经细胞线粒体形态有显著改善。铁代谢和脂质过氧化是介导铁死亡发生的关键因素。机体内的Fe3+通过细胞膜上的TFR1结合内吞进入胞内。Fe3+在胞内被还原成Fe2+，Fe2+在胞内的过度累积会通过芬顿(Fenton)反应促进氧化自由基及脂质过氧化产物MDA的生成，加重神经细胞的损伤[23-24]。最近有研究表明，中草药脑泰方通过降低大鼠脑组织中TFR1的表达水平，减轻了ROS和Fe2+的累积以及缓解了脑I/R大鼠的神经功能障碍[25]。在本研究中，使用AICAR预处理后，脑I/R小鼠脑组织中TFR1蛋白的表达、Fe2+及MDA的含量显著下降。我们分析这可能是AICAR预处理抑制了脑I/R过程中TFR1蛋白的表达，从而降低了脑I/R过程中Fe2+的过度累积和脂质过氧化物的生成。

SLC7A11作为谷氨酸-胱氨酸转运体(System Xc-)的重要组成成分，负责胞外的胱氨酸和胞内的谷氨酸的运输[26]。在铁死亡、细胞氧化还原稳态等多种病理生理过程中发挥着重要的调节作用[27]。GPX4产生于细胞膜上，可以直接降低过氧化物磷脂水平，GPX4活性降低时无法抑制细胞内ROS的产生，导致脂质过氧化物的积累和产生致死量的ROS，从而诱导细胞发生铁死亡[28-29]。有文献表明，SLC7A11和GPX4作为抵抗铁死亡发生的关键蛋白在神经系统I/R损伤中的表达均有显著性降低[25]。在沙鼠的脑I/R损伤中，姜科植物的提取物高良姜素通过上调SLC7A11和GPX4的表达来抑制由脑I/R引起的铁死亡[30]。在本研究中，脑I/R小鼠的脑组织中GPX4和SLC7A11的表达降低，而使用AICAR预处理后GPX4和SLC7A11的表达均有显著性增高。这提示我们，激活AMPK所起到的抗脑I/R小鼠铁死亡的保护作用可能与上调GPX4和SLC7A11的表达有关。

AMPK作为机体内重要的能量感受器，激活AMPK在抗脑I/R损伤中有着重要的保护作用。在肿瘤细胞中，Lee等[15]的研究发现激活AMPK通过调节不饱和脂肪酸的合成，进而抑制细胞铁死亡。在脑I/R中，本研究证实了激活AMPK减轻脑I/R损伤的机制可能与其抑制铁死亡有关。铁死亡作为近年来在脑I/R中研究的重点方向，如何减轻脑I/R中铁死亡的发生进而降低神经损伤仍需要进行大量的研究。我们希望通过对激活AMPK与铁死亡关系的探讨为诠释脑I/R损伤的发生机制提供理论依据。