许金国，夏金鑫，梅 茜，赵晓莉，张科卫，毛 靖，高红宁，李 鹏，毛春芹*，陆兔林*

1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023

2.南京海陵中药制药工艺技术研究有限公司，江苏 南京 210023

经典名方来源于古代医疗记载，是历代医药学家的经验总结，是我国医学宝库的重要组成部分。为了推动经典名方的开发研究，国家药品监督管理局于2019年3月发布了《古代经典名方中药复方制剂及其物质基准的申报资料要求（征求意见稿）》（以下简称《申报资料要求》）[1]，加强对经典名方的质量管理。

当归四逆汤（Danggui Sini Decoction，DSD）出自东汉张仲景《伤寒论》[2]，原方由当归、桂枝、白芍、细辛、甘草、木通、大枣7 味药组成，具有温经散寒、养血通脉等功效，主治血虚寒厥证。现代临床主要用于治疗痛经、糖尿病周围神经病变、类风湿性关节炎等疾病[3-6]。DSD 的相关研究主要集中于临床应用方面，对质量控制方面的研究相对较少。本课题按照《申报资料要求》对经典名方DSD进行指纹图谱研究，并借助网络药理学构建DSD“成分-靶点-通路”网络，综合预测分析其潜在的功效关联物质。为全面控制和评价经典名方DSD 的质量提供依据，为经典名方复方制剂的质量控制提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Waters e 2695 型高效液相色谱仪，包括四元泵、柱温箱、自动进样器、PDA 检测器和Empower 工作站，美国Waters 公司；ZYX0071 型超纯水系统，南京汉隆实验器材有限公司；MS-105DU 型十万分之一电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；MG- H21S011 多功能电陶炉，广东美的生活电器制造有限公司；TD5001C 型电子天平，天津天马衡基仪器有限公司；H1650-W 型台式高速离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；KQ-500B 型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；砂锅，江西舒雅陶瓷有限公司。

1.2 试药

对照品阿魏酸（批号110773-201915，质量分数99.4%）、桂皮醛（批号110710-201217，质量分数99.5%）、肉桂酸（批号110786-201604，质量分数98.8%）、芍药苷（批号110736-201943，质量分数95.1%）、细辛脂素（批号111889-201705，质量分数100.0%）、甘草苷（批号111610-201908，质量分数95.0%）、甘草酸铵（批号110731-202021，质量分数96.2%），中国食品药品检定研究院；对照品藁本内酯，CAS：4431-01-0，质量分数＞98%，南京森贝伽生物科技有限公司；对照品芍药内酯苷，批号4644，质量分数100%，上海诗丹德标准技术服务有限公司；对照品邻甲氧基桂皮醛，批号S28D9G711659，质量分数≥98%，上海源叶生物科技有限公司。乙腈，色谱纯，默克股份两合公司；甲醇，色谱纯，江苏汉邦科技有限公司；纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；其他试剂均为分析纯。

DSD 由当归、桂枝、白芍、细辛、甘草、木通和大枣7 味药组成，均购自于道地产区或主产区，每味药共收集不少于3 个产地，总批次不少于15批。经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定分别为伞形科植物当归Angelica sinensis(Oliv.) Diels.的干燥根、樟科植物肉桂Cinnamomum cassiaPresl.的干燥嫩枝、毛莨科植物芍药Paeonia lactifloraPall.的干燥根、马兜铃科植物北细辛Asarum heterotropoidesFr.Schmidt var.mandshuricum(Maxim.) Kitag.的干燥根和根茎、豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.的干燥根和根茎、木通科植物三叶木通Akebia trifoliata(Thunb.) Koidz.的干燥藤茎和鼠李科植物枣Ziziphus jujubaMill.的干燥成熟果实。本实验前期已按照《中国药典》2020年版项下各味药的检测方法和检测要求对药材进行检测，选出优质产地的药材：当归（甘肃岷县）、桂枝（广东肇庆）、白芍（安徽亳州）、细辛（辽宁新宾）、甘草（甘肃民勤）、三叶木通（陕西西安）、大枣（山东新泰）。按照《中国药典》2020年版及全国饮片炮制规范项下相关要求将药材炮制成15 批饮片。经检测饮片均符合《中国药典》2020 版项下相关规定。利用Excel 中RANDBETWEEN 函数生成随机数，将当归、桂枝、白芍、细辛、木通、炒甘草、大枣7 味饮片的不同批次随机组合，DSD 批次组合具体信息见表1。

表1 DSD 组合信息Table 1 Combination information of DSD

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液；梯度洗脱：0～3 min，5%乙腈；3～10 min，5%～10%乙腈；10～15 min，10%～12%乙腈；15～30 min，12%～14%乙腈；30～35 min，14%～17%乙腈；35～40 min，17%～19%乙腈；40～50 min，19%～25%乙腈；50～75 min，25%～45%乙腈；75～90 min，45%～70%乙腈；90～92 min，70%～95%乙腈；92～95 min，95%～5%乙腈；体积流量1.0 mL/min；检测波长245 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL。

2.2 对照品溶液的制备

取各对照品适量，精密称定，加甲醇配制成含阿魏酸3.34 μg/mL、藁本内酯2.20 μg/mL、肉桂酸2.22 μg/mL、邻甲氧基桂皮醛2.50 μg/mL、芍药苷104.20 μg/mL、芍药内酯苷13.90 μg/mL、细辛脂素3.77 μg/mL、甘草苷17.61 μg/mL、甘草酸34.16 μg/mL 的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

按照处方比例称取7 味饮片量：当归9 g，桂枝9 g，白芍9 g，细辛9 g，炒甘草6 g，木通6 g，大枣24 g。置砂锅中，加水1600 mL，浸泡45 min，以武火（2200 W）煮沸后，调节火力至1000 W，开盖，保持微沸并煮至600 mL，趁热用100 目筛滤过，即得DSD 物质基准对应实物。

取DSD 物质基准对应实物3 mL，置10 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，称定质量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度考察 取DSD 物质基准对应实物1份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，连续进样6 次，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以18 号峰（甘草酸）为参照峰，计算各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明各共有峰的相对保留时间RSD 值均小于0.18%，相对峰面积RSD 值均小于3.30%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性考察 取DSD 物质基准对应实物1份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行制备6 份，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以18 号峰（甘草酸）为参照峰，计算各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各个共有峰的相对保留时间RSD 值均小于0.91%，相对峰面积RSD 值均小于3.82%，表明该方法的重复性良好，可用于DSD 指纹图谱的检测。

2.4.3 稳定性考察 取DSD 物质基准对应实物1份，按照“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。以18 号峰（甘草酸）为参照峰，计算各个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各个共有峰的相对保留时间RSD值均小于0.90%，相对峰面积RSD 值均小于2.08%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.5 DSD 物质基准对应实物指纹图谱的建立及相似度评价

取23 批DSD 物质基准对应实物供试品溶液与对照品溶液按色谱条件进行测定，记录色谱图。通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012A）软件，以S1 为参照峰，采用平均数法，进行多点校正和色谱峰匹配，得到23 批DSD 物质基准对应实物指纹图谱叠加图、共有模式图和混合对照品图，共确认25 个色谱峰，指认9 个色谱峰。结果见图1、2。与对照指纹图谱相比，23 批DSD 物质基准对应实物指纹图谱的相似度均＞0.90，表明DSD 物质基准对应实物的相似度良好，主要物质群差异性小，制备工艺较为科学合理，形成的物质基准对应实物对照图谱能够作为衡量DSD 物质基准对应实物的标准参照物，结果见表2。

图1 23 批DSD 物质基准对应实物HPLC 指纹图谱叠加图Fig.1 HPLC fingerprint of 23 batches of DSD substance standard corresponding substance

图2 DSD 物质基准对应实物HPLC 共有模式图 (A) 和混合对照品HPLC 图 (B)Fig.2 Common pattern of HPLC fingerprint of DSD substance standard corresponding substance (A) and HPLC of mixed reference substances (B)

2.6 DSD 物质基准对应实物指纹图谱共有峰的归属

按供试品制备方法分别制备单味饮片供试品溶液、缺单味饮片供试品溶液、和DSD 物质基准对应实物供试品溶液。取DSD 物质基准对应实物、单味饮片、缺单味饮片供试品溶液按上述色谱条件进行测定，记录色谱图。分别将DSD 物质基准对应实物、单味饮片、缺单味饮片供试品溶液的色谱图进行叠加比较，对DSD 物质基准对应实物指纹图谱的色谱峰进行归属分析，结果见图3 和表3。 根据图3 和表3 对DSD 物质基准对应实物指纹图谱中各共有峰进行归属分析，DSD 物质基准对应实物指纹图谱共确认25 个色谱峰，均可以在原料饮片中找到明确归属。具体归属情况为4、22 号峰归属于当归饮片；9、11、15 号峰归属于桂枝饮片；2、3、7 号峰归属于白芍饮片；1、4、19、20、23～25 号峰归属于细辛饮片；5、6、8～10、12～14、16～18、21 号峰归属于甘草；其中4 号峰为当归、细辛所共有，9 号峰为桂枝、甘草所共有。经对照品指认9 个色谱峰，分别为2 号峰芍药内酯苷、3号峰芍药苷、4 号峰阿魏酸、5 号峰甘草苷、11 号峰肉桂酸、15 号峰邻甲氧基桂皮醛、18 号峰甘草酸、22 号峰藁本内酯和23 号峰细辛脂素，主要药效成分的指认率为36.0%。综上可知，DSD 物质基准对应实物的物质群可清晰的追溯到饮片，且色谱峰归属明确，指认率较高。

表2 23 批DSD 物质基准对应实物HPLC 指纹图谱相似度Table 2 Similarity of HPLC fingerprints of 23 batches of DSD substance standard corresponding substance

从色谱峰个数与峰强度看，甘草对指纹图谱的贡献最大，当归、桂枝、白芍和细辛对指纹图谱的贡献度相对较大，木通、大枣对指纹图谱的贡献较低。木通主要含三萜及其苷类，其指标性成分木通苯乙醇苷B 在饮片炮制过程中损失严重，导致含量大幅度下降，在DSD 煎煮过程中由饮片转移至水煎液的量极少，在此色谱条件下未检测出色谱峰。大枣主要成分为多糖和氨基酸类物质，水溶性大，含量较低，且大枣中指标性成分齐墩果酸、白桦脂酸等物质极性较小，由饮片转移至水煎液的量极少， 在此色谱条件下不能检出色谱峰。因此，木通、大枣2 味饮片，在本实验色谱条件下难以获得指纹图谱信息。

图3 DSD 物质基准对应实物色谱峰归属Fig.3 Attribution of chromatographic peaks of DSD substance standard corresponding substance

表3 DSD 物质基准对应实物共有峰归属情况Table 3 Attribution of common peaks of DSD substance standard corresponding substance

2.7 基于网络药理学的DSD 功效物质预测分析

2.7.1 基于可测性和可追溯性的活性成分筛选 根据文献研究，当归、桂枝共为DSD 的君药，其中阿魏酸为药典项下当归的质量控制指标，藁本内酯为其挥发油主要成分；邻甲氧基桂皮醛是桂枝挥发油主成分之一，肉桂酸为非挥发油成分，受热较稳定，具有抗菌、利胆、抗突变、抗肿瘤、抗疲劳等药理作用[7]。白芍、细辛均为臣药，其中芍药苷为白芍的质量控制指标，具有镇痛、解除痉挛、保护脑血管等作用，芍药苷、芍药内酯苷等统称为芍药总苷，具有补血、抗抑郁等作用[8]；细辛主要活性成分为挥发油和木脂素类，细辛脂素为药典项下细辛的质量控制指标，具有镇痛、抗炎等作用[9-10]。甘草为佐药，其活性成分为黄酮类、三萜类，甘草苷具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用，甘草酸具有抗炎镇咳、免疫调节等作用，均为药典项下甘草含量测定的质量控制指标[11-12]。木通的主要成分为三萜、苷类成分，大枣的有效成分为多糖类。文献研究结合DSD 的指纹图谱研究，以上类别中9 个活性成分均能得到指认，且能够从饮片到物质基准对应实物进行传递。基于可测性和可追溯性，将这9 个活性成分做为候选化合物。利用 NCBI 数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找9 个候选化合物的Canonical SMILES，为后续DSD“成分-靶点-通路”网络的构建做准备。

2.7.2 DSD 主要成分成分的靶蛋点预测 将9 个活性成分的Canonical SMILES 编号分别导入Swiss Target Prediction 数据库（http://www.swisstarget prediction.ch/）预测分析其对应的靶蛋白，去除重复靶点，共得到与9 个活性化合物相关的271 个作用靶点。

2.7.3 蛋白-蛋白相互作用（ protein-protein interaction，PPI）网络构建 将筛选得到的271 个作用靶点导入STRING 数据库（https://string-db.org/）构建PPI 网络，选择物种为“Homo sapiens”，蛋白交互参数评分值为“high confidence＞0.9”，网络显示选项为“hide disconnected nodes in the network”，其余参数设置均保持不变，得到271 个靶蛋白的PPI 网络图（图4）。将分析结果以TSV文本格式导入 Cytoscape 3.7.1 软件，并利用Cytoscape 3.7.1 软件中的“Network Analyzer”功能对分析结果进行网络拓扑分析，计算选取度值（degree）、介数中心性（betweenness centrality）和接近中心性（closeness centrality）3 个重要拓扑参数均大于中位数且度值≥10 的靶点作为关键靶点。经筛选得到48 个关键靶点，结果见表4。

图4 271 个靶蛋白的PPI 网络图Fig.4 PPI network diagram of 271 target proteins

表4 靶点网络的拓扑学性质Table 4 Topological properties of target network

2.7.4 基因本体（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 将PPI 网络构建筛选得到的48 个关键靶点利用David 6.8 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对其进行GO功能富集分析和KEGG 通路富集分析。GO 功能富 集分析和KEGG 通路富集分析均根据“P≤0.01”和“Benjamini≤0.01”进行筛选。

续表4

GO 功能富集分析共获取97 个GO 条目。其中生物过程（biological process，BP）占62 条，细胞组成（cell composition，CC）占9 条，分子功能（molecular function，MF）占26 条。根据显著性程度进行部分展示，结果见图5。BP 主要包括血小板活化、细胞外调节蛋白激酶1（extracellular regulated protein kinases 1，ERK1）和ERK2 级联的正调控、药物反应、MAP 激酶活性的正调控等方面；CC 主要涉及质膜、胞质溶胶等过程；MF 主要涉及酶结合、蛋白激酶活性等过程。KEGG 通路富集分析共富集到78 条通路，根据显著性程度进行部分展示，结果见图6。根据图表可知，DSD 9 个活性成分富集的通路主要包括癌症、磷脂酰肌醇-3-羟激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase-protein kinase B，PI3K-Akt）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）通道的炎性介质调节等信号通路。

图6 DSD KEGG 富集分析Fig.6 KEGG enrichment analysis of DSD

2.7.5 “成分-靶点-通路”网络的构建 根据筛选得到的9 个活性成分、48 个关键靶点和78 条信号通路，运用Cytoscape 3.7.1 软件，建立DSD“成分-靶点-通路”网络图，结果见图7。由图可知，DSD相关活性成分通过调控不同的蛋白靶点，作用于多条通路发挥治疗作用。

图7 DSD“成分-靶点-通路”网络图Fig.7 “Ingredient-target-pathway” network diagram of DSD

2.7.6 整合分析 DSD 具有温经散寒、养血通脉等功效，主治血虚寒厥症，临床主要用于治疗痛经、糖尿病周围神经病变、类风湿性关节炎、肿瘤等疾病。本研究通过文献研究和指纹图谱研究基于可测性和可追溯性对DSD 相关活性成分进行网络药理学分析，并对其作用机制进行探讨分析。研究显示，DSD 筛选得到9 个活性化合物，共获得271 个靶点，通过构建PPI 网络图并选用度值、接近中心性、介数中心性3 个拓扑参数进行分析，筛选得到48 个关键靶点。

经分析，DSD 9 个活性成分可能通过作用于去甲肾上腺素受体（norepinephrine receptor，ADR）发挥镇痛作用，作用于乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，CHRM）影响神经信号传导[13]；蛋白激酶C（protein kinase C，RKC）是G 蛋白偶联受体系统中的效应物，通过抑制PKC 的激活，改善皮肤微血管血流紊乱和微血管功能障碍[14]；IL-2 属于炎症因子，可用于调控炎症反应，VEGFA 能够引起血管新生，诱导细胞凋亡，抑制VEGFA、IL-2 的表达可减轻疼痛和炎症反应[15-16]；ESR1 对生殖功能、性发育有重要作用，同时与痛觉传递有关，可用于调节阴阳，稳定生理功能[17-18]；基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）能够抑制癌细胞的侵袭与迁移，达到治疗癌症的作用[19-20]。

GO 功能富集分析显示，共获取97 个GO 条目，主要包括血小板活化、MAPK 级联的正调节、MAP激酶活性的正调控等生物过程，质膜、胞质溶胶等细胞组成和酶结合、蛋白激酶活性等分子功能，主要以生物过程为主，涉及神经-激素分泌调节、细胞生长增殖、能量代谢等生物学过程。

KEGG 通路富集分析显示，DSD 9 个活性成分主要涉及癌症、PI3K-Akt、MAPK、TRP 通道的炎性介质调节等信号通路。经研究，MAPK 信号通路参与细胞多种生理过程，是重要的信号转导系统之一，与炎症、肿瘤等多种疾病有关[16]；PI3K-Akt、MAPK 信号通路与细胞增殖、凋亡有关，通过调控PI3K-Akt、MAPK 等信号通路能够抑制癌细胞增殖并诱导其凋亡，促进造血和血小板生成，有可能是发挥补血、活血作用的重要通路[21-22]；TRP 通路是一类离子通道，与炎症和疼痛的发生密切相关，通过调控TRP 通路，拮抗TRPV1 等TRP 通道家族成员，缓解关节炎疼痛，常用于治疗类风湿性关节炎、骨关节炎、痛风等疾病[23-24]；叉头型转录因子的O亚型（forkhead transcription factor of the O class，FOXO）、低氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）等信号通路与造血功能有关，通过调控以上通路能够促进O2、营养物质的转运，使细胞免受缺氧损伤，促进血管和红细胞生成[25]。同时，卻丹华等[16]研究发现，DSD 可通过调控MAPK、花生四烯酸等信号通路治疗痛经；李文婷等[26]、张伏芝[27]研究发现通过调控MAPK、PI3K-Akt、HIF-1、晚期糖基化终末产物（advanced glycation end products，AGEs）等信号通路能够治疗糖尿病周围神经病变；程邦[28]经研究发现DSD 通过调控TNF、HIF-1、癌症通路、雌激素、VEGF 等信号通路干预类风湿性关节炎。由此推测，DSD 中关键效应成分可通过作用于多个靶点，干预多条通路达到温经散寒、养血通脉的作用。

基于指纹图谱和网络药理学研究，阿魏酸、肉桂酸、芍药苷等9 个成分具有传递性和溯源性，且与DSD 的功能属性密切相关，可预测其为影响DSD品质的潜在功效关联物质。

3 讨论

DSD 由当归、桂枝等7 味药组成，成分复杂，为了尽可能全面的分析其所含的化学成分，本研究对色谱条件和供试品提取条件进行考察。通过考察不同的检测波长（237、245、280、290、316 nm）、流动相系统（甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%甲酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液）、色谱柱（Waters XBridge C18色谱柱、Merck Purospher Star LP RP18endcapped 色谱柱、Hanbon Hedera ODS-2 色谱柱）、体积流量（0.6、0.8、1.0 mL/min）、柱温（25、30、35 ℃）等项目，确立了DSD 指纹图谱分析方法中色谱条件的关键要素：色谱柱为 Waters XBridge C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测波长245 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；流动相为乙腈- 0.05%磷酸水溶液；梯度洗脱；结合DSD 组成药味的药典提取方法对供试品溶液的提取溶剂种类（甲醇、乙醇）和提取溶剂体积分数（0、30%、50%、70%醇溶液）进行考察，发现以70%甲醇为提取溶剂时色谱峰基线平稳，提取情况较佳，因此，选择70%甲醇超声提取。通过以上研究，确立DSD 指纹图谱的分析方法。

经典名方由多味药组成，成分复杂，具有多成分、多靶点、多通路的特点，同时经典名方的组方配伍又注重君臣佐使的配伍关系，通过组方配伍对相关疾病进行治疗，使其作用机制研究困难。本实验以指纹图谱为指标，全面考察DSD 原料饮片-物质基准对应实物的关键质量属性的传递性。结果显示，DSD 物质基准对应实物共确认25 个峰，指认9 个色谱峰，均能在原料饮片中找到明确归属。从色谱峰个数与峰强度看，甘草对指纹图谱的贡献最大，当归、桂枝、白芍和细辛对指纹图谱的贡献度相对较大，木通、大枣对指纹图谱的贡献较低。木通指标性成分木通苯乙醇苷B 在饮片炮制过程中损失严重，导致含量大幅度下降，在DSD 煎煮过程中由饮片转移至水煎液的量极少，在此色谱条件下未检测出色谱峰；大枣主要成分为多糖和氨基酸类物质，水溶性大，含量较低，在此色谱条件下未检出色谱峰。因此，木通、大枣2 味饮片，在本实验条件下难以获得指纹图谱信息，后期可结合其他质量控制方法对其进行全面的质量控制。

网络药理学主要是基于系统生物学的理论，对生物系统的网络分析，选取特定信号节点进行多靶点药物分子设计的新学科，具有系统性与整体性的特点，可用于阐释及分析中药复方制剂配伍之间的作用关系及作用机制[29-31]。本实验将指纹图谱与网络药理学相结合，通过对经典名方DSD 进行指纹图谱研究，并采用网络药理学识别技术，构建DSD的“成分-靶点-通路”网络，预测分析与DSD 的功能主治密切相关的核心靶点、信号通路及功效关联物质，进一步推进对经典名方复方制剂作用机制的研究。

本研究基于指纹图谱及网络药理学研究，分析预测DSD 温经散寒、养血通脉功效关联物质，为后期DSD 复方制剂全方位的质量控制及作用机制研究奠定基础，有助于建立全过程的质量控制体系，提高中药产业质量控制水平。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突