郑 燕，江 媛， 冯 展，曾铁鑫，缪雨静，张 翔，黄林芳*

1.中国医学科学院北京协和医学院 药用植物研究所，国家中医药管理局中药资源保护重点研究室，北京 100193

2.中药资源教育部工程研究中心，北京 100193

3.江西中医药大学，江西 南昌 330000

4.大理大学，云南 大理 671000

丹参为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根和根茎[1]，始载于《神农本草经》，列为上品，后世《吴普本草》《日华子本草》等均有记载[2-5]。现代药理研究表明，丹参具有多种生物学活性，包括抗肿瘤、抗菌、消炎和心血管保护作用，常用于治疗冠心病、肝炎、神经衰弱等疾病[6-9]。近年来，国内外学者研究了丹参的抗肿瘤和心血管疾病的保护作用[10-12]及在流行性感冒病毒（influenza virus）感染过程中的抗流感病毒和免疫调节的作用[13]。

流感是一种具有高发病率和死亡率的病毒感染性疾病，严重威胁着人类健康，近年来，全世界每年约有50 万人死于流感病毒[14-15]。流行性感冒病毒是正粘病毒科（Orthomyxoviridae）的代表种，简称流感病毒[16]。人流感病毒分为甲、乙、丙3 型，且甲型流感易于变异[17]。目前，市场上有2 种主要类型的抗流感药物，为奥司他韦和扎那米韦。但这些抗流感药物存在较多不良反应[18-19]。因此，寻找和开发抗流感的中药资源迫在眉睫。

超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱仪（UPLC-Q-TOF-MS）是一种先进的化学成分定量和定性分析工具[20]。本研究通过UPLC-Q-TOF-MS 鉴定了丹参提取物的化学成分，将主要化学成分与神经氨酸酶（neuraminidase，NA）对接，以可视化的方式探索其对流感病毒的抑制作用，再进行NA 抑制实验，以进一步探索其抑制活性。实验流程见图1。

图1 实验流程Fig.1 Flow chart

1 材料

Acquity UPLC-Synapt MS 色谱-质谱联用仪（包括MassLynx V4.1 质谱工作站，美国Waters 公司），PURELAB Classic-UVF 纯水机（英国ELGA 公司）。甲醇（色谱纯，Fisher），甲酸（色谱纯），超纯水，其他试剂为分析纯。

对照品紫草酸（质量分数 98.1%，批号1053003）、迷迭香酸（质量分数95%，批号111871- 201102）、丹酚酸A（质量分数96.3%，批号171217）、丹酚酸B（质量分数94.1%，批号150927）、丹参酮IIA（质量分数98.5%，批号110766-201121）、二氢丹参酮（质量分数98.9%，批号11041211）、隐丹参酮（质量分数94.8%，批号110852-201107）和丹参酮I（质量分数97.6%，批号110867-201107）购自成都曼思特生物科技有限公司。奥司他韦酸（质 量分数＞98%，批号S80494）购自Medchem Express（美国新泽西州Monmouth Junction）；NA 抑制剂筛选试剂盒（批号P0309），碧云天生物技术有限公司（中国上海）。

新鲜丹参采自云南省大理市，经中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所黄林芳教授鉴定为唇形科鼠尾草属植物丹参S.miltiorrhizaBge.的干燥根及根茎，样品（CMPB04801）存放在中国医学科学院药用植物研究所标本馆。

2 方法

2.1 待测样品制备

将干燥丹参样品粉碎为细粉，取500 g 细粉，加入2.5 L 石油醚，浸泡24 h，后回收石油醚，得石油醚提取物。残渣挥去石油醚，残渣用80%乙醇回流提取3 次，每次2 h；合并提取液，减压回收乙醇至无醇味，用等体积醋酸乙酯萃取2 次，合并醋酸乙酯萃取液（上层），浓缩至干，得醋酸乙酯萃取物。为进一步评估石油醚和乙醇提取物的抗流感病毒活性，使用UPLC-Q-TOF-MS 对活性更好的提取物进行定性分析。取初提物，溶于甲醇，使其质量浓度为5 mg/mL，后用0.22 μm 微孔膜滤过，既得供试品溶液[21-23]。

2.2 UPLC-Q-TOF-MS 分析

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相：0.1%的甲酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱：0～2 min，5% B；2～4 min，5%～10% B；4～8 min，10%～15% B；8～18 min，15%～20% B，18～22 min，20%～30% B。进样量 2 µL，进样温度15 ℃。

2.2.2 质谱条件 采用电喷雾电离离子源（ESI），正/负离子模式检测m/z100～1200，毛细管电压2.2 kV（ESI−）或3.0 kV（ESI+），锥孔电压10～40 kV，离子源温度100 ℃，脱溶剂温度450 ℃，雾化气N2，体积流量60 L/h，脱溶剂气N2，体积流量800 L/h，碰撞气Ar，碰撞压力7.066 mPa，质量校正质核比m/z556.277 1。使用甲酸钠校准质谱仪，用亮氨酸-脑啡肽以5 µL/min 的恒定体积流量进行外部参考。

2.3 NA 抑制实验

参照试剂盒说明书，神经氨酸酶抑制试验在96孔微培养板中进行。设置5 个样品组（样品质量浓度分别为25、50、100、150、200 µg/mL），5 个阳性药组（阳性药质量浓度分别为25、50、100、150、200 µg/mL）及1 个空白组，样品组及阳性药组设置3 个重复。向每个孔中添加70 μL 缓冲液和10 μL NA，后分别向样品组添加丹参提取物，向阳性药组添加奥司他韦酸，进行振动混合1 min，然后在37 ℃下反应2 min。加入10 μL NA 荧光底物后，将混合物在37 ℃和30 min 振动1 min。将激发波长设置为322 nm，发射波长设置为450 nm，在微孔板分光光度计上读取荧光值。按照公式计算抑制率。

Fm为无药孔的荧光值，Fs为样品的荧光值，F0为空白组的荧光值

2.4 统计分析

使用IBM 19（BM SPSS，美国伊利诺伊州芝加哥）[24]计算半数抑制浓度（IC50）。

3 结果

3.1 丹参不同提取物的NA 活性测定

乙醇和石油醚提取物的NA 抑制活性见图2，奥司他韦酸作阳性对照。结果表明，乙醇提取物比 石油醚提取物具有更强的NA 抑制活性。乙醇提取物的抑制活性随浓度的增加而增加，故采用UPLC-Q-TOF-MS 分析丹参乙醇提取物。

图2 丹参石油醚醚及乙醇提取物的NA 抑制活性Fig.2 NA inhibitory activity of PE and ethanol extract of S.miltiorrhiza

3.2 丹参的UPLC-Q-TOF-MS 分析

由于丹酚酸和丹参酮分别在负离子和正离子扫描模式下敏感，因此在正离子和负离子模式下均可获得丹参的质谱图（图3）。根据保留时间、分子离子、主要碎片并根据文献，初步确定了36 种化合物[25-34]。鉴定出的化合物大致分为酚酸和醌，主要化学结构见图4，化合物信息见表1。

图3 丹参乙醇提取物的基峰色谱图Fig.3 Base peak chromatogram (BPC) of ethanol extract of S.miltiorrhiza

由于丹参显著的药理活性，紫草酸、丹参酸、丹酚酸A、丹酚酸B、迷迭香酸、原儿茶醛、原儿茶酸和其他衍生物引起了相当大的关注[39-40]。丹酚酸B 通常用作丹参的质量指标。丹参中的大多数酚酸由咖啡酸衍生物组成。负离子扫描模式中丹酚酸B 的主要片段为m/z5193 21。据推测，它去除了1个丹参素，形式为m/z519.1，去除了2 个丹参素，形式为m/z32。

大多数丹参二萜类化合物，如二氢丹参酮I、丹参酮IIA、丹参酮I 和隐丹参酮，均具有 [2M＋Na]+的二聚体[41]。这些二萜类化合物的碎片离子主要为H2O、CH3和CO。丹参酮IIA在正离子扫描模式下的主要碎片为m/z280、277、262、252、249。我们推测m/z280 由m/z295 去除甲基（-CH3），m/z277 通过m/z295 脱水（-H2O），m/z262 通过m/z277去除甲基（-CH3），m/z249 通过去除m/z280 中的一氧化碳（-CO）导致m/z277 和m/z252 中的一氧化碳（-CO）损失。

3.3 主要化合物的分子对接

分子对接是分子建模的重要方法之一。其本质是2 个或更多分子之间的识别。该过程涉及分子之 间的空间匹配和能量匹配[42]。分子对接操作环境2014.09（Chemical Computing Group Inc，Montreal，QC，Canada）和蛋白质晶体（PDB ID：3TI3）来自PDB 数据库（http://www.rcsb.org/pdb）[43]。本研究旨在模拟NA 与丹参主要成分的识别与对接，并比较NA 抑制实验的结果。本研究选择8 种主要化合物，即紫草酚酸、迷迭香酸、丹酚酸A、紫草酚酸B、丹参酮IIA、二氢丹参酮I、二氢丹参酮、隐丹参酮和丹参酮I，利用PharmaDB 目标数据库将这些化合物连接到3TI3，自由能绝对值高，生物活性高。表2 结果表明，上述化合物生物活性大小分别为丹参酮I（−38.908 kJ/mol）＞丹参酮II（−7.826 kJ/mol）＞丹酚酸B（−6.528 kJ/mol）＞紫草酸（−5.549 kJ/mol）＞迷迭香酸（−4.207 kJ/mol）＞二氢丹参酮（3.013 kJ/mol）＞隐丹参酮（−2.419 kJ/mol）＞丹酚酸A（−0.508 kJ/mol）。自由能绝对值最高的前4 种化合物与NA 的结合方式见图5。

3.4 丹参主要化合物的NA 活性测定

图4 丹参主要化合物的结构Fig.4 Structural formula of main compounds from S.miltiorrhiza

表1 UPLC-Q-TOF/MS 鉴定丹参乙醇提取物中的36 种成分Table 1 Thirty-six constituents identified in ethanol of S.miltiorrhiza extracts by UPLC-Q-TOF/MS

续表1

表2 丹参中8 种化合物的自由能值Table 2 Free energy values of eight compounds of S.miltiorrhiza

NA 是分布在流感病毒包膜上的糖蛋白，被认为是筛选抗甲型和乙型流感药物的重要靶标。结果表明，与石油醚提取物相比，丹参的乙醇提取物对 NA 的抑制作用更好。为了确认提取物的生物活性化合物，筛选了鉴定出的8 种标准化合物的NA 抑制活性。奥司他韦酸用作阳性对照。结果表明，8种化合物均显示抑制活性，并显示出剂量相关性作用（图6）。8 种化合物的抗流感病毒IC50依次为紫草酚酸（157.44 mol/L）＞迷迭香酸（204.74 mol/L）＞丹参酮IIA（300.74 mol/L）＞丹酚酸A（307.86 mol/L）＞丹参酸B（310.07 mol/L）＞二氢丹参酮（321.47 mol/L）＞奥司他韦酸（361.83 mol/L）＞丹参酮I（566.09 mol/L）＞隐丹参酮（584.57 mol/L）。研究结果表明，丹参提取物在体外具有抗流感病毒 的活性，因此丹参具有抗病毒潜力，但尚需进一步研究验证。

图5 与NA 对接的化合物的三维 (1) 和二维 (2)图 Fig.5 Three-dimensional (1) and two-dimensional (2) maps of compounds docking with NA

4 讨论

流感是一种具有高度传染性的疾病，可导致高发病率和死亡率。抗病毒药物是治疗流感的有效方法，但是由于流感病毒的频繁突变，流感对药物逐渐产生抗药性。由于流感病毒对药物的广泛耐药性，开发了市场上的扎那米韦、奥司他韦和帕拉米韦等药物。但是，这些药物具有副作用和其他缺点。因此，迫切需要寻找新的天然药物资源。然而，一些天然中草药具有抗流感作用，本研究为探究丹参的抗流感作用，通过UPLC-Q-TOF-MS 鉴定了丹参提 取物的化学成分，并结合了NA 活性测定和分子对接技术对主要活性成分进行了评估。初步确定了36 种化合物。其中，4 种化合物（紫草酚酸、迷迭香酸、丹参酮IIA、丹酚酸A）与NA 的亲和性良好。上述化合物均显示出NA抑制活性，其中丹酚酸A表现最佳。

图6 丹参乙醇提取物的8 种成分的神经氨酸酶抑制活性 ( ± s , n=3, a) 和IC50 (b)Fig.6 Neuraminidase inhibitory activity of eight constituents of ethanol extracts in S.miltiorrhiza ( ± s , n=3, a) and IC50 (b)

中药是中国中医药事业传承和发展的物质基础，中药又因其含有许多化学成分，具有复杂性、多样性的特点，近年来研究发现中药在预防和治疗流感病毒中发挥极其重要的作用[44]。丹参是大宗药材，迄今已有2000 多年药用历史，具有较高的药用价值。明晰其化学成分，探究其主要化合物（紫草酚酸、迷迭香酸、丹参酮IIA及丹酚酸A）对NA 的抑制活性，为将其开发为抗流感病毒的中药资源提供了理论依据。

丹参可能通过多途径、多靶点发挥抗病毒作用，为明晰其抗流感机制，还需对其体内抗病毒作用机制进行深入研究，为其临床抗流感病毒应用提供理论支撑。为进一步探究丹参抗流感潜在应用价值，课题组后期将在体内外对紫草酚酸，迷迭香酸，丹参酮IIA及丹酚酸A 的抗流感机制进行深入研究，进一步阐明丹参抗流感病毒的机制。本研究为抗流感新药的研发提供了参考。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突