高晓新，朱春玥，李雪梅，王佳帅，张茜茜，郭玉东，曹春然，胡宇驰

(北京市药品检验所，国家药品监督管理局创新药物安全研究与评价重点实验室，中药成分分析与生物评价北京市重点实验室，北京 102206)

气虚血瘀指心气虚弱、运血无力、心脉瘀阻，以心悸气短、胸闷心痛、神疲乏力、面色紫暗、舌淡紫、脉弱而涩等为常见症的证候，临床治疗以益气活血为主。据已有研究及中药用药理论，北京某三甲医院研制了益气活血方剂“TLTX”(方剂组成：红景天、红参、丹参、川芎、龙血竭、冰片，另外添加β-环糊精用于冰片包合)，具有益气活血、通络止痛之功效，用于气虚血瘀所致的胸痹、胸痛胸闷、心悸气短、倦怠乏力和冠心病心绞痛等，临床疗效较好，但尚无长期毒性试验数据支持。有研究从大鼠血管新生[1]和内皮功能[2]等角度探讨了TLTX的药理机制。我们依据《中药、天然药长期毒性试验技术指导原则》及相关文献[3-5]，观察了大鼠连续口服TLTX 13、26周及停药4周后的毒性反应，探讨TLTX的毒性反应及安全剂量，以期为临床应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 药物及仪器

1.1.1 药物 TLTX浸膏粉由北京某三甲医院提供，每1 g浸膏粉相当于3.54 g生药，性状：棕褐色粉末、味微苦。批号：20130801。

1.1.2 动物 SPF级SD大鼠176只，体质量140～160 g，雌雄各半，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证号：SCXK(京)2012-0001。

1.1.3 仪器 OLYMPUS AU400全自动生化仪、TE2101-L电子天平、PB602-N电子天平、BS224S电子天平、TE2101-L电子天平、PB602-N电子天平、Leica ASP-200组织脱水机、Leica EG 1150H组织包埋机、Leica RM 2245半自动切片机、Leica AutoStainer XL染色机、Leica DM 3000光学显微镜。

1.2 方法

大鼠适应环境饲养6 d后，按体质量随机分为TLTX浸膏粉高(H)、中(M)、低剂量组(L)和阴性对照组(N)，每组雌雄大鼠各22只。TLTX高、中、低剂量组给药剂量为生药含量21.2、10.6、5.3 g·kg-1，阴性对照组给予纯化水。采用口服给药，各剂量组每日上午给药1次，连续给药26周。

1.3 测定指标

给药期间，前4周每周测定大鼠体质量2次，5～26周每周测定大鼠体质量1次；给药前和给药后0.5～4 h内各观察1次大鼠状态，每周按笼测定动物摄食量。

给药13、26周及停药4周后，每组分别剖检12、20、12只大鼠(雌雄各半)。剖检前禁食12.0～13.5 h，麻醉后腹腔静脉采血测定Urea、CR；留取肾脏称重计算脏器系数(双侧合并)；制作肾脏病理切片进行组织病理学观察，病变程度分为极轻、轻度、中度和重度。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0处理数据，行单因素方差分析，根据方差分析结果，行Dunnett-t检验，各给药组与阴性对照组比较。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况、体质量及摄食量情况

各给药组动物的行为活动、外观体征与阴性对照组比较未见异常改变；雄性动物中剂量组于给药第2周体质量增加，与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。个别周内给药组动物摄食量与阴性对照组比较有一定差异，但无时间连续性和剂量-效应关系，无统计学意义。

2.2 肾功能生化检测指标比较

给药26周高剂量组雌性大鼠CR与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，但在正常参考值范围内，且无剂量-效应和时间-效应关系；其余各期各给药组大鼠血清Urea、CR与阴性对照组比较差异无统计学意义(表1～2)。

表1 不同时期SD大鼠血清Urea检测结果

表2 不同时期SD大鼠血清CR检测结果

2.3 肾脏系数比较

给药13周高剂量组雄性大鼠、中剂量组雌性大鼠肾脏系数与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)；给药26周低、中、高剂量组雄性大鼠肾脏系数与阴性对照组比较差异有统计学意义(P<0.05，P<0.01，P<0.01)(表3)。

表3 不同时期SD大鼠肾脏系数

2.4 组织病理学情况

给药13周：阴性对照组雄性大鼠肾脏未见异常，个别雌性大鼠偶见极轻透明管型。3个给药组雄性大鼠存在剂量-效应相关的肾小管上皮胞浆和/或管腔内极轻到轻度玻璃样小滴变性、肾小管极轻到轻度萎缩；中高剂量组极轻透明管型，个别大鼠还出现极轻慢性炎细胞浸润、肾小管上皮细胞轻度脱落坏死；少数低剂量组雌性大鼠、个别中剂量组大鼠存在极轻肾小管透明管型。给药26周：阴性对照组雌性大鼠肾脏出现极轻到轻度肾小管萎缩、慢性炎细胞和透明管型，雄性大鼠肾小管上皮胞浆中出现极轻玻璃样小滴变性，病理形态改变雄性大鼠重于雌性大鼠。与给药13周同剂量组比较，给药26周雄性大鼠病变有所加重、雌性大鼠病变增多，表现出一定的时间-效应关系；与阴性对照组比较，各给药组大鼠病变发生率高、病变程度严重，给药组间病变存在一定的剂量-效应关系。停药后4周：阴性对照组大鼠病理形态改变有加重趋势；3个给药组大鼠病理形态改变未见明显好转。(表4～5、图1～12)。

表4 雄性动物肾脏组织病理学主要病变发生情况(n)

表5 雌性动物肾脏组织病理学主要病变发生情况(n)

3 讨 论

TLTX作为院内制剂可能存在潜在安全性隐患，开展临床前安全性评价有重要意义。根据《中药、天然药长期毒性试验技术指导原则》的要求[3]，为充分暴露，TLTX高剂量组按最大药物浓度和最大给药体积设置，大鼠给药高、中、低剂量分别达到临床拟用剂量的70、35、17.5倍。本实验中经连续灌胃给药26周，TLTX高、中、低剂量组大鼠一般情况、体质量、摄食量及肾脏功能指标未见明显异常；给药期间部分大鼠肾脏指数明显升高；病理形态学显示给药组大鼠肾脏存在透明管型、肾小管萎缩、肾小管上皮细胞极轻脱落坏死和肾小管扩张，雄性大鼠肾小管上皮内玻璃样小滴变性，病变程度雄性重于雌性，上述病变都符合慢性进行性肾病的特点[6-8]。本研究中上述病变程度均较轻，初步判断为慢性进行性肾病早期阶段。慢性进行性肾病是试验大鼠高发的自发性肾病，本研究中阴性对照组也出现极轻的病理形态学改变，且表现出增龄性特点。本研究中各给药组病变发生率及严重程度与给药剂量相关，TLTX低剂量组给药13周即可引起病理形态学改变，且停药后4周未见明显好转，病变不可逆，病理形态学改变与TLTX可能存在一定的相关性。

综上，建议进一步进行控制TLTX肾毒性风险研究。